利用实时荧光定量RT-PCR检测鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达

依据鸡A-FABP和H-FABP基因及参照基因GAPDH序列设计引物,以鸡心肌、胸肌和腿肌、肝脏和腹脂总RNA逆转录合成的cDNA为模板,GAPDH基因为参照基因,应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测如皋黄鸡和安卡红鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达。结果表明:A-FABP、H-FABP基因和参照基因GAPDH基因融解曲线为单峰,无杂峰及二聚体,其扩增效率分别为99.7%、99.8%和100.0%。如皋黄鸡H-FABP基因在心肌、胸肌和腿肌的差异表达量分别是安卡红鸡的0.0860、0.0680倍和0.0580倍(P0.05)。H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪含量呈显著负相关。如皋黄鸡A-FABP基因在腹脂和肝脏的表达量分别是安卡红鸡的15.9640倍和10.9640倍(P0.05),而在心肌、胸肌和腿肌的表达量差异不显著。     

Real-time PCR在病毒学研究中的应用

在病毒学研究中,对体内外病毒载量及细胞基因表达水平进行定量分析,对于从分子水平上揭示病毒的致病机理、病毒和机体之间的相互作用等十分必要[1].在众多对核酸定量的方法中,实时荧光定量PCR,简称Real-time PCR或Kinetic PCR,是20世纪90年代发展起来的一项新技术,由于其与常规PCR相比,具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、无需PCR后电泳、全封闭反应等优点,在多个学科领域中都得到了应用.文章就Real-timePCR技术在病毒学研究中的应用进行了简要概述.     

鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立鸡胚致死孤儿病毒CELO的荧光定量PCR检测方法,实现该病毒在鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测.方法根据CELO L5纤突1序列设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度进行考察.运用建立的方法对40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种进行CELO检测.结果:建立的荧光定量PCR其最佳线性范围为1x109~1x104拷贝/μl,R2值达0.99以上,特异性良好,与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应,灵敏度为102拷贝/μl;荧光定量PCR方法检测40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感毒种结果为阴性.结论:本研究所建立的鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法,特异性好,敏感性高,为鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测提供了技术支撑.     

鸡传染性支气管炎病毒Real-time PCR方法的建立及应用

为建立一种快速定量检测鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的方法,试验针对H120株5 '端非编码区保守区域序列设计一对特异性引物,构建重组质粒作为阳性标准品进行SYBR Green I Real-time PCR,建立了定量检测IBV的标准曲线与直线回归方程;同时,应...     

非洲猪瘟病毒常规PCR及Real-time PCR检测方法的建立

根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)P72基因的核苷酸序列,设计并合成引物以及荧光标记的TaqMan探针,以含P72基因的重组质粒作为阳性模板,用于常规PCR和Real-time PCR方法的建立,结果表明常规PCR的检测灵敏度是600个拷贝的病毒核酸分子,Real-time PCR的检测灵敏度是20个拷贝的病毒核酸分子,两种PCR检测方法均具有特异性强、简单快速的优点。可以用于出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测。     

鸡传染性支气管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其对感染鸡体内病毒的检测

本研究针对传染性支气管炎病毒（IBV）tl／CH／LDT3／03毒株的N基因（GenBank登录号为AY702975）设计并合成了一对引物,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBV核酸的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法可检测到初始模板中6．45×10copies／μL的病毒核酸。与常规PCR相比,敏感性高100倍。该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、禽流感病毒（AIV）、马立克氏病毒（MDV）均不发生交叉反应;重复性试验的变异系数小于2．6％。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于传染性支气管炎的临床诊断。同时应用本方法对人工感染IBV的SPF鸡的主要脏器盲肠扁桃体、肾脏、肺和气管进行了病毒RNA定量检测,结果表明,肾脏的病毒含量最高,盲肠扁桃体中病毒持续的时间最长,从而揭示了IBV在SPF鸡体内复制的动态变化,证实了感染鸡的临床表现与病毒滴度的时间相关性。     

不同品种鸡MSTN基因表达差异的研究

家禽中肌纤维的形成分为两个阶段:孵化阶段和出生以后.在孵化阶段,主要是成肌细胞增殖、分化、转移和融合等多个过程形成肌管,肌管最后分化形成肌纤维.在鸟类中,肌纤维总数在出雏前就已经确定,出生以后肌肉量的增加主要是靠已有纤维的卫星细胞相互融合而使纤维膨大[1,2].     

鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因荧光定量PCR检测方法的建立

为对鸡髓样分化因子88(MyD88)、包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF)和包含Toll/IL-1的接头蛋白(TIRAP)基因的进行定量检测,本研究参考鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因序列,设计并合成特异性引物,以β-actin为内参基因,建立检测对应基因的实时荧光定量PCR方法.结果表明,4个基因的扩增效率为96.7%～102%,相关系数均在0.997以上;特异性强,扩增产物均形成单一的特异性熔解峰;敏感性高,可以检测到对应基因达10-13g/mL;重复性好,变异系数均在1.5%以下.本研究所建立的荧光定量PCR方法可用于鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因表达研究.     

荧光定量PCR分析水牛胚胎致密化相关基因表达方法的建立

胚胎致密化是哺乳动物早期胚胎发育过程中一个非常重要的环节,有研究发现致密化相关基因的表达水平与体外发育胚胎的质量之间存在着相互关联作用。为了分析水牛胚胎早期发育中致密化相关基因在mRNA水平上的表达并确定其定量分析方法,本研究根据黄牛有关基因序列设计了Cx43、Cx31、E-cad以及组蛋白基因(Histone H2A)引物序列,分析了黄牛和水牛致密化基因的同源性,并确定各目的基因在水牛胚胎的SYBR Green I实时定量PCR反应条件。     

钙蛋白酶基因在鸡不同组织和品种中的表达差异

为了探讨钙蛋白酶(calpain,CAPN)基因在鸡不同组织和品种中的表达差异,本研究采用半定量RT-PCR方法研究了CAPN基因在鸡不同组织和品种中的表达差异。结果表明:CAPN基因表达于优质鸡的10个不同组织中,肝脏和胸肌中的表达量最高并显著高于其他组织(P<0.05);优质鸡胸肌组织中CAPN基因的表达量显著高于艾维茵肉鸡和宝万斯尼拉蛋鸡品种(P<0.05),优质鸡品种之间以及肉鸡与蛋鸡品种间差异不显著(P>0.05)。结果证明钙蛋白酶是一种在鸡体内普遍存在的蛋白,CAPN基因在鸡不同组织和品种中的表达存在显著差异。     

不同品种猪肌肉组织心型脂肪酸结合蛋白基因的表达差异

用体重约100kg DLY杂交猪和雅南猪各5头，屠宰取骨骼肌和心肌样品，采用RT—PCR方法研究心型脂肪酸结合蛋白（H—FABP）基因在不同品种猪肌肉组织表达的差异。结果表明：H—FABP基因表达于猪的骨骼肌和心肌中，但是其在2种肌肉组织中的表达量不同，心肌中表达量极显著高于骨骼肌（P〈0．01）；心肌和骨骼肌H-FABP基因的表达量2品种猪差异不显著（P〉0.05），但无论是心肌还是骨骼肌雅南猪的表达量都高于DLY杂交猪。     

雏鸡不同组织TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR15 mRNA转录水平相对定量研究

参考GenBank登录的ChTLRs基因序列设计实时定量PCR特异性引物,建立检测鸡Toll样受体(ChTLR)mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析ChTLR1、ChTLR2、ChTLR4、ChTLR5和ChTLR15在雏鸡不同器官组织中的转录水平。结果显示5种ChTLRs在脾脏、法氏囊、胸腺和各段肠道组织中均有转录。其中,ChTLR1 mRNA在法氏囊、肾脏和盲肠组织中转录水平较高;ChTLR2 mRNA在脾脏、法氏囊和肝脏等组织中转录水平较高,在肾脏、肺脏和皮肤未检测到转录;ChTLR4 mRNA在所检测组织中转录水平差异较小,在脾脏、十二指肠和胸腺转录水平较高;ChTLR5 mRNA在肾脏、脾脏和空肠中的转录水平较高;ChTLR15 mRNA在法氏囊中转录水平最高,其次为脾脏和盲肠。本研究建立了检测ChTLRs mRNA在不同器官组织中表达水平的实时定量PCR方法,ChTLRs mRNA在雏鸡各器官组织中转录水平差异较大,可能与雏鸡各器官组织对病原的识别和抵抗能力有关。     

北京鸭H-FABP多态与屠体性状相关分析

应用聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）的方法,以心脏-脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP）为侯选基因,对6周龄北京鸭的3个群体（区分公母）共300个个体进行SNP分析。结果发现H-FABP第3内含子以本试验采用的引物碱基为第一碱基的第156碱基处发生1个C/G突变,此突变对Z4群体胴体质量、皮脂质量、皮脂率和全净膛质量有显著影响,并且对Z4（公）群体中胸肌质量、腿肌质量以及骨架质量有显著影响,因此可以将心脏-脂肪酸结合蛋白基因作为影响北京鸭Z4群体屠体性状的侯选基因。     

五指山猪H-FABP基因不对称PCR-SSCP研究

以海南五指山猪为试验材料,采用不对称PCR-SSCP和测序相结合技术,对海南五指山猪心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因第3内含子(intron 3)进行多态检测,并分析其与生长性状(体重、体高、体长、胸围)的相关性。结果表明:在五指山猪H-FABP基因in-tron 3中发现了3种基因型,分别命名为AA、AB、BB,对其中的纯合子AA、BB进行测序,发现intron 3的第335位点处发生了突变,都是由碱基A→G的转换造成。AA、AB、BB三种基因型频率分别为63.5%,18.2%,18.2%,A、B等位基因频率分别为73%和27%。不同基因型个体各生长性状的方差分析表明,不同基因型之间的生产性状无显著差异。     

H-FABP基因在脂肪沉积中作用的研究进展

心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein,H-FABP)是脂肪酸结合蛋白家族中的一员,在长链脂肪酸摄取与氧化中起重要作用,常被作为影响脂肪沉积的候选基因之一加以研究.作者就H-FABP基因在猪、鸡、牛等动物脂肪沉积中的研究作一简要综述,并探讨了H-FABP基因作为影响脂肪沉积的候选基因的实际意义.     

鸡H-FABP和A-FABP基因表达与肌内脂肪含量相关研究

选用H-FABP和A-FABP基因作为影响鸡肌内脂肪沉积的候选基因,以北京油鸡、矮脚鸡、白莱航鸡和AA肉鸡为研究群体,利用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术,分别对56、90、120日龄H-FABP和A-FABP基因mRNA进行定量分析,结合IMF含量及屠体性状测定,分析H-FABP及A-FABP基因表达水平对IMF含量等的影响.结果表明：H-FABP基因mRNA随日龄的增长表达量显著降低,而A-FABP基因mRNA随日龄的增长表达量显著升高,并表现出显著的品种效应（P＜0.01）,性别因素对A-FABP基因表达影响显著.北京油鸡、白莱航鸡和AA鸡群体的H-FABP基因mRNA表达水平与IMF含量及屠体重呈现显著的负相关,而A-FABP基因mRNA表达水平与屠体重显著相关,与IMF含量没有显著的相关性.矮脚鸡A-FABP基因mRNA水平与IMF含量呈现显著的负相关,其H-FABP基因mRNA水平对屠体重影响显著,表现出显著的品种差异.     

三江白猪H-FABP基因多态性和肌内脂肪含量相关性分析

利用PCR-RFLP技术检测了80头三江白猪H-FABP基因的5'-上游区和第2内含子区的遗传变异,并用最小二乘法模型分析了H-FABP基因对猪肌内脂肪含量的遗传效应。结果表明:在H-FABP基因5'-上游区域HinfⅠ-RFLP和第2内含子MspⅠ-RFLP均不存在多态性,基因型为HH和AA。第2内含子HinfⅠ*-RFLP(基因型BB、Bb、bb)和HaeⅢ-RFLP(基因型DD、Dd、dd)均有多态性,肌内脂肪含量bb高于Bb型,但肌内脂肪含量差异不显著(P>0.05);dd基因型肌内脂肪含量显著高于Dd和DD基因型(P<0.05)。通过各种组合基因型发现,AAddbbHH基因型具有最高的IMF含量,因此可通过提高"AAddbbHH"基因型的频率来增加肌内脂肪含量,达到改善猪肉质的目的。     

绵羊心脏脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性分析

试验旨在探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）基因在绵羊中的遗传多态性,并寻找可用于辅助选择的分子标记。本研究以滩羊（250只）及滩羊×湖羊杂交F1代（174只）为试验动物,利用SNaPshot分型技术对H-FABP基因（GenBank登录号：AY157617）的多态位点进行单核苷酸多态性（SNP）分析,统计基因频率和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）和有效等位基因数（Ne）等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体重、体长、体高、胸围、胸深、胸宽和管围等生长性状的关联性。结果显示：①检测到9个多态位点：939[A/G]、980[G/A]、1018[T/C]、2878[C/T]、2956[C/T]、3017[G/A]、3341[G/C]、3394[T/A]、1056[-/G],其中有6处转换、2处颠换、1处单碱基插入。②939[A/G]、980[G/A]、2956[C/T]、3341[G/C]、3394[T/A]和1018[T/C]的He为0.3200~0.4666,PIC为0.2688~0.3577;2878[C/T]、3017[G/A]位点的He为0.0283~0.1272,PIC为0.0279~0.1191,为低度多态;1056[-/G]位点的He在滩羊、滩羊×湖羊杂交F1代群体中分别为0.0120和0,PIC在滩羊、滩羊×湖羊杂交F1代群体中分别为0.0119和0;9个多态位点在滩羊、滩羊×湖羊杂交F1代群体中均符合Hardy-Weinberg平衡定律。③5个多态位点：939[A/G]、980[G/A]、2956[C/T]、3341[G/C]、3394[T/A]处于紧密连锁（D'>0.99）,将H-FABP基因分为3个单倍型：AA、AB和BB。④在41只滩羊×湖羊杂交F1代羊中,BB单倍型在各生产性状上具有最大值,但各单倍型间差异不显著（P>0.05）。结果表明,绵羊H-FABP基因具有丰富的遗传多态性,939[A/G]、980[G/A]、2956[C/T]、3341[G/C]、3394[T/A]5个位点紧密连锁,BB单倍型可能是与绵羊生产性状相关的优势单倍型。     

江苏地方山羊品种H-FABP基因的SNPs检测及群体遗传学分析

采用PCR-SSCP和DNA测序技术对2个江苏地方山羊品种的心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein,H-FABP)基因进行单核苷酸多态性(SNP)检测和群体遗传学分析。结果表明,在所扩增的片段中,仅在H-FABP基因外显子2的第132位检测到G/C碱基突变,形成GG和GC基因型,2个山羊群体均是纯合GG基因型占主导优势,且该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态;黄淮山羊群体的杂合度、有效等位基因数和多态信息含量指标均高于长江三角洲白山羊群体,表明其群体内的遗传变异程度相对较大、遗传多样性也更为丰富。