不同方法提取银杏叶片总RNA及RT-PCR

以银杏叶片为材料,分别采用CTAB法、SDS法和TRIzol法提取银杏叶片总RNA.结果表明:CTAB法、SDS法所提取的RNA经电泳检测,28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA 3务带清晰,RT-PCR得到的条带与目的片断大小一致,说明所提取的RNA纯度高、质量好;TRIzol法所得到的RNA降解严重,没有得到完整的电泳条带.CTAB法和SDS法适于富含多糖和多酚等物质的植物总RNA提取.     

基因克隆及序列分析

 采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH （甘油醛三磷酸脱氢酶）基因的部分序列(EU022331),长度为604 bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。     

鸡脂肪组织总RNA提取方法的优化和RT-PCR检测

提取完整的RNA是基因表达分析中的基础,但由于脂肪组织含有大量的油脂,所以从脂肪组织中提取高质量的RNA有一定的困难。在本研究中,报道了经过优化TRIzol试剂操作程序成功地从肉鸡脂肪中分离出了完整、高质量、纯度好的总RNA。用该方法提取的RNA显示清晰的28S、18S和5S三条带,OD260/OD280均值为1.893,浓度均值为263μg/mL。保温试验与RT-PCR扩增鸡LPL和GAPDH基因的分析结果也证明了所提取的总RNA质量较高。     

小麦GAPDH 基因克隆及序列分析

采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH（甘油醛三磷酸脱氢酶）基因的部分序列（EU022331）,长度为604bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦（M36650）、玉米（AY109397）、番茄（BT012693）GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。     

文心兰GAPDH基因片段的克隆及序列分析

采用Trizol法提取文心兰花期花葶总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了文心兰GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的2个部分序列,长度均为875 bp,编码291个氨基酸残基.序列分析结果表明,与其它已登录物种的GAPDH基因相比,其核苷酸序列的同源性均在79％以上,与蕙兰(JN177724.1)同源性高达到92％,氨基酸序列的同源性也在85％以上;且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性.本研究已克隆出文心兰GAPDH基因的部分cDNA同源序列片段,分别命名为OnGA1和OnGA2,并在GenBank注册,登录号分别为JN981141和JN981142.     

玫瑰花柱总RNA提取方法的比较研究

为获得一种玫瑰(Rosa rugosa)花柱总RNA提取的理想方法,为后续相关基因工程研究奠定基础。以玫瑰花柱为材料,用核酸蛋白仪和凝胶电泳法比较了改良CTAB 法、Trizol 法以及EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的玫瑰花柱总RNA的纯度、浓度及完整性,利用RT-PCR反应检测了其反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明：改良CTAB法提取的总RNA纯度、浓度较高,但存在严重降解现象;Trizol 法提取的总RNA纯度和浓度极低;EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的总RNA纯度和浓度较高,条带清晰,且28S 条带亮度是18S 条带亮度的2 倍,将其反转录获得的cDNA用于RT-PCR,能够扩增出清晰的特异性条带。综上所述：EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法从玫瑰花柱中提取的RNA质量最好,完全能够满足后续的玫瑰分子生物学研究要求。     

提取高质量茶树总RNA的方法研究

由于茶树富含多糖、多酚,从茶苗组织中尤其是从茶苗的根中提取高质量的RNA较为困难,试用了多种方法都未能获得高质量的RNA.为此,作者借鉴多年生的草本植物RNA提取方法-CTAB法,并在此基础上进行了改进,首次提取茶苗嫩根中的总RNA.电泳检测显示,该方法提取的总RNA 28S和18S条带清晰且28S较18S条带亮,紫外光谱分析显示A260/A280的比值为1.93.用于RT-PCR反应,成功克隆了492 bp的谷氨酰胺合成酶基因片段.说明用该方法提取的RNA纯度和完整性好.试用该方法从营养成分丰富的茶籽胚中提取总RNA,效果同样很好.     

半滑舌鳎GAPDH基因开放读码框的克隆及序列分析

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)广泛存在于真核生物中,对许多生理活动具有重要作用.参考金头鲷和斑马鱼的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因序列设计一对简并引物,提取半滑舌鳎肌肉组织总RNA,采用RT-PCR技术对GAPDH基因进行克隆测序及序列分析.结果表明,从半滑舌鳎肌肉组织中成功克隆了GAPDH基因的开放读码框(ORF),序列全长1002 bp,编码333个氨基酸,分子量为36.0235 ku,等电点PI为7.75.序列同源性分析显示,该序列与其他鱼类的GAPDH氨基酸序列具有较高的同源性.     

山羊子宫中LHR基因片段的克隆及半定量RT—PCR检测方法的建立

【目的】进一步研究处于发情周期不同阶段的济宁青山羊子宫中黄体生成素受体(LHR)mRNA表达量的变化,为探讨其对山羊生殖内分泌机制的作用规律提供理论依据。【方法】以GAPDH为内参照基因,从济宁青山羊的子宫组织中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增目的基因,进行克隆测序,并对半定量RT-PCR反应体系进行了优化。【结果】获得了济宁青山羊LHR mRNA的部分序列,长度约为286 bp,与已报道的GenBank中羊的LHRmRNA(序列号为AF379199)41~326 bp序列同源性为100%。以此基因片段的阳性克隆为基础优化的半定量RT-PCR体系为:LHR基因的适宜循环数为30个,内参照GAPDH基因的循环数为26个,Mg2+浓度均为1.5 mmol/L。【结论】克隆了山羊LHR mRNA的部分序列,并建立了优化的半定量RT-PCR体系。     

适合软枣猕猴桃花蕾转录组测序的总RNA提取方法研究

为了得到符合转录组测序要求的软枣猕猴桃花蕾RNA,比较了Trizol法、十二烷基苯磺酸钠(SDS)法、天根植物总RNA提取试剂盒以及改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法的提取效果。结果表明,Trizol法、SDS法和天根植物总RNA提取试剂盒均不能有效提取到软枣猕猴桃花蕾总RNA,改良后的CTAB法提取的RNA 28S和18S条带清晰,通过RT-PCR方法扩增出软枣猕猴桃Actin基因片段。将纯化后的RNA送样至测序公司,经深度检测样品合格,可以上机进行转录测序。