酵母表达芥子酶基因TGG4、TGG5的酶学特性差异研究

十字花科植物广泛存在芥子酶,并利用芥子酶以抵御病虫害的侵袭。TGG4和TGG5是在拟南芥中发现的新型芥子酶基因,二者基因序列极为相近。本试验通过对转TGG4和TGG5基因酵母的诱导表达及相应重组蛋白的纯化,探讨两个蛋白的酶学差异性。结果表明:TGG4、TGG5的最大Vc激发浓度都为1mmol/L;但是在最适反应温度和最适反应pH上,两个重组蛋白略有不同,TGG4和TGG5的最适温度分别为67℃和57℃,而最适pH分别为6.5和5.5,TGG4比TGG5要耐高温耐碱性;这两个重组蛋白酶活性都受NaCl的抑制。     

拟南芥芥子酶基因TGG4的克隆、表达和酶活性鉴定

芥子酶是一类水解硫代葡萄糖苷的酶,广泛存在于十字花科植物中。人们在拟南芥中已经发现了3个芥子酶基因,分别是TGG1、TGG2和TGG3。通过对拟南芥基因组数据库的搜索,发现3个新的芥子酶基因TGG4、TGG5和TGG6。本研究克隆了TGG4基因全长cDNA序列,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115,进行甲醇诱导表达,重组蛋白用离子交换层析柱纯化。纯化的重组蛋白经测定具有芥子酶活性,而且其活性被低浓度的维生素C激活,具有芥子酶的典型特征。芥子酶系统发生树分析进一步表明,TGG4代表一个芥子酶基因新亚家族。     

拟南芥根部芥子酶活性测定条件及其与重组蛋白酶学活性比较研究

芥子酶是一类降解硫代葡萄糖苷的酶,该基因表达具有组织特异性。研究表明,新型芥子酶TGG4和TGG5都是在根部表达。为了研究TGG4、TGG5的功能作用,提取了生态型拟南芥Col-0根部以及含有重组蛋白酵母的芥子酶,进行了酶活性条件测定以及对比分析。结果表明：根部芥子酶有更高的抗坏血酸激活浓度为2 mmol/L;根部芥子酶同重组蛋白的最佳反应温度以及pH范围一致,在37℃,体系缓冲液pH 4.5时,根部芥子酶活性测定效果最好;NaCl对根部芥子酶和重组蛋白芥子酶都有强烈抑制作用。因此推断根部芥子酶在耐盐碱、耐高温方面没有起作用,该酶也不能帮助根部抵御病虫侵袭,但是对根部的生长起到重要作用。     

拟南芥TGG5基因的克隆、表达和酶学特性

芥子酶是广泛存在于十字花科植物中的一类降解硫代葡萄糖苷的酶。当植物受到病虫侵袭时, 芥子酶与其底物硫代葡萄糖苷结合,释放有毒的水解产物形成植物重要的化学防御系统。TGG5 是新 发现的一类芥子酶基因,对其研究将有利于揭示芥子酶防御系统的功能。试验克隆了拟南芥TGG5 基 因cDNA,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115。经甲醇诱导表达和Ni 亲和层析,获得纯化的 TGG5 重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在58 kD左右,并有较明显拖尾,呈现典型 的糖基化蛋白的特征。进一步探讨了TGG5 重组蛋白的酶学特性,结果表明：该芥子酶的Km为1.96 mmol/L,Vmax为0.084 mmol/(min·mg);酶反应的最适pH 为5.5;该芥子酶在37~80℃范围内有较广泛的 温度适应性,并具有较好的80℃热稳定性;NaCl对该酶有明显的抑制作用;低浓度抗坏血酸具有激活芥 子酶的作用,抗坏血酸终浓度为1.5 mmol/L时,酶活力最大。RT-RCR分析,证实了TGG5 只在拟南芥根 中特异表达,这表明TGG5 可能代表了一个芥子酶基因新亚家族。     

巴西蕉果肉类黄酮生物合成特点及其关键酶基因的差异表达分析

为了明确巴西蕉果肉类黄酮生物合成的特点及其关键酶基因的差异表达特性,本研究选取抽蕾期(0 DAF)、断蕾期(20 DAF)、采收期(80 DAF)、成熟度Ⅱ期(8 DPH)、成熟度Ⅵ期(16 DPH)的巴西蕉的果肉,分别测量总黄酮的含量,观察其变化趋势。分别提取根、叶、花、果实以及上述五个时期的果肉RNA进行转录组测序,分析类黄酮生物合成关键酶基因在不同组织器官及不同发育成熟阶段的表达特性,并对其中10个关键酶基因的表达进行验证。结果表明从抽蕾期至断蕾期再到采收期,巴西蕉果肉黄酮含量呈明显的下降趋势,至采收时下降到最低点,在采后成熟过程中小幅上升再下降。类黄酮生物合成6个关键酶基因家族共78个基因在巴西蕉不同组织器官中是差异表达的,其中3个基因在根、叶、花和果实中都高水平表达,有42个、11个、18个、8个基因分别在根、叶、花、果实中高表达;这78个基因也在巴西蕉果实不同发育成熟阶段差异表达,有4个基因在果实发育成熟阶段都高水平表达,有27个、27个、19个、15个、9个基因分别只在抽蕾期、断蕾期、采收期、成熟度Ⅱ期和成熟度Ⅵ期中高水平表达;类黄酮生物合成关键酶基因CHS(Ma02_t24860.1)、CHI(Ma11_t21950.1)和F3'H(Ma03_t31570.1和Ma05_t26350.1)与总黄酮的变化趋势相似,推测这4个关键酶基因在香蕉果实黄酮生物合成过程中具有非常重要的作用。研究结果可为解析巴西蕉类黄酮生物合成的分子机制提供帮助。     

RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的种子特异性分析

为研究RNAi沉默转基因油菜fad2基因表达的效果及其器官特异性,实时荧光定量PCR法分析比较了转基因油菜W-4与非转基因对照Westar开花后第7天、第14天、第21天、第28天的种子以及越冬期油菜根、茎、叶器官中的fad2基因的相对表达量。结果显示:对照Westsr种子中fad2基因的相对表达量随开花后的天数呈逐渐增加的趋势,但W-4种子中fad2基因的相对表达量在开花后第21天、第28天较对照Westar显著下降,降幅达到60%。说明转基因油菜W-4在种子发育过程中表达的fad2基因的dsRNA干扰了fad2基因表达。W-4与Westar在越冬期根、茎、叶器官中fad2基因的相对表达量基本一致,无显著性差异。脂肪酸组成分析结果显示:W-4种子中油酸平均含量达到81.5%较Westar增加了近15%,而多不饱和脂肪酸平均含量为5.25%,较Westar下降了近70%;但根、茎、叶中的脂肪酸含量二者无显著差异;结果表明转基因油菜中RNAi干扰fad2基因表达具有种子特异性,不干扰其它器官的fad2基因表达。研究还发现转基因油菜fad2基因表达下降的时期与napin基因表达时期同步,均始于开花后21d左右,表明目标基因的表达受napin启动子的准确控制。     

一个陆地棉类烯醇酶基因的克隆及其表达分析

 采用改良的CTAB法提取陆地棉总RNA,运用RT-PCR技术首次克隆了陆地棉类烯醇酶基因的CDS序列,该基因已经在GenBank上登录,登录号为 EU169604,其开放阅读框为1338 bp,编码445个氨基酸残基。对其序列和进化分析表明,陆地棉烯醇酶基因与其它植物中的烯醇酶基因有较高的相似性,该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示该基因在陆地棉的叶、根、茎中均有表达,但在根中的表达量高于叶和茎。     

百脉根ACC氧化酶基因LcACO1的克隆及序列分析

植物激素乙烯参与植物生长发育多个生理过程的调控。ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的关键合成酶。本研究依据其它物种ACC氧化酶序列信息设计简并引物,并结合RT-PCR和快速扩增c DNA末端技术从牧草百脉根中首次克隆到ACC氧化酶基因的全长c DNA序列,命名为LcACO1。LcACO1全长c DNA为1 012 bp,具有一个924 bp ORF可编码307个氨基酸残基。生物信息学分析表明,LcACO1是含有Fe2+依赖的加氧酶结构域的稳定亲水蛋白,没有信号肽和跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质。与其它植物中的ACO蛋白进行同源性比对显示,LcACO1蛋白与鹰嘴豆中ACO蛋白的一致性高达90%。实时荧光定量PCR表明,LcACO1基因在百脉根不同组织器官中差异表达,根中表达量最高,推测其主要在根的生长发育调节方面发挥作用。     

木薯Linamarase基因的克隆、表达及酶学特性分析

亚麻仁苷酶(Linamarase)是存在于木薯、巴豆等作物中的降解生氰葡萄糖苷Linamarin（亚麻仁苷）的酶,在结构上与芥子酶有很大的相似性,对它的研究有利于揭示生氰葡萄糖苷酶和芥子酶之间的关系以及芥子酶的起源问题。通过真核表达的方法,克隆了木薯Linamarase基因,构建酵母表达载体,转化毕赤酵母GS115,经诱导表达和亲和纯化,获得纯化的Linamarase重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在71 kD左右。该酶最适反应温度在37℃左右,最适pH约为5。以pNPG为底物时,Km为1.70 mmol/L,最大反应速率Vmax为8.36 μmol/(min?mg)。     

甘蓝型油菜脯氨酸合成相关同源基因的进化和差异表达分析

以异源四倍体甘蓝型油菜(Brassica napus)及其二倍体祖先白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)为对象,研究了脯氨酸合成途径关键酶基因P5CS和OAT的进化命运以及各自不同祖先来源的同源基因的差异表达情况。序列比对和进化分析表明,甘蓝型油菜中P5CS基因和OAT基因和其二倍体祖先的相对应基因高度同源;进化上,和二倍体亲本相比甘蓝型油菜P5CS2基因发生了1个拷贝的丢失,而OAT基因没有基因丢失现象;半定量RT-PCR结果表明,甘蓝型油菜中来自二倍体亲本白菜和甘蓝的P5CS2和OAT同源基因在所有检测器官中均表达,没有发生基因沉默;但是它们可能发生了亚功能化,不同祖先来源的2个P5CS2同源基因存在较弱的偏向性表达,不同器官的同源基因表达模式稍有不同;而OAT基因明显偏向于表达来自于甘蓝祖先的同源基因,OAT的2个同源基因的不同器官表达模式基本一致;盐胁迫处理后,来自于甘蓝的BnaC.P5CS1.d表达量显著高于来自于白菜的Bna A.P5CS1.a,表明盐处理条件下甘蓝型油菜偏向性表达BnaC.P5CS1.d。甘蓝型油菜的脯氨酸合成基因Bna A.P5CS1.a、BnaC.P5CS1.d及Bna A.P5CS2.a、BnaC.P5CS2.c的盐诱导表达模式均基本保持了亲本来源基因的特征。以上结果表明,与二倍体祖先相比,甘蓝型油菜中脯氨酸合成基因序列和表达模式均存在高度保守性,这可能说明了脯氨酸积累在进化上对植物的有利性。     

对甘蔗受黑穗病菌侵染后差异表达基因的分离与鉴定

采用12个3''锚锭引物和8个5''随机引物构建引物组合, 运用DDRT-PCR差异显示方法, 分析NCo376和F134两品种接种黑穗病菌前后的基因表达差异。经克隆、测序和半定量RT-PCR验证, 获得7条真实差异表达片段, 这些片段分别同GenBank中编码细胞色素C氧化酶基因、核糖体蛋白基因、NAD-依赖型苹果酸脱氢酶基因、氨基转移酶基因、乙烯响应相关结合蛋白基因、RNA聚合酶特异转录起始因子和反转录转座子的序列的同源性达28%~99%。半定量RT-PCR分析表明, 细胞色素C氧化酶基因的表达受甘蔗黑穗病菌和水杨酸的调控, 不依赖于过氧化氢的作用机制, 在甘蔗根、茎、叶中表达的抗病基因组成型表达, 但表达水平较低。推测甘蔗受黑穗病菌侵染后, 可能通过细胞色素C氧化酶基因的诱导, 促使植保素合成增多, 以此抵抗或抑制病原菌的胁迫。该结果丰富了甘蔗与黑穗病菌互作的分子机制研究, 为甘蔗抗黑穗病分子育种奠定了基础。     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

甘蓝和白菜紫色酸性磷酸酶17基因家族的克隆和比较分析

从甘蓝和白菜中分别克隆到2个PAP17, 根据序列相似性, 将PAP17分为类型I (BoPAP17-1和BrPAP17-1)和类型II (BoPAP17-2和BrPAP17-2)。Southern杂交表明, 白菜和甘蓝中均只存在2个PAP17成员, 与克隆结果吻合。系统发育和分子进化分析表明, PAP17基因家族受纯化选择, 编码低分子量PAP蛋白。荧光定量PCR结果表明, PAP17在所检测的9个组织器官中均有表达, 尤以花和蕾中的表达量特别高, 种子中也有一定程度的表达, 表明其与体内储备态磷的动用有关, 尤其在花和蕾的发育阶段。磷饥饿诱导表达结果表明, 除BrPAP17-2在幼苗叶片中表达受抑制外, BrPAP17和BoPAP17在幼苗根部和叶片中均受磷饥饿诱导, 表达量先降后升, 诱导4 d或8 d后达到峰值; 恢复供磷4 d后, 表达量迅速降低至基础表达水平以下。与幼苗叶片相比, 白菜和甘蓝幼苗根部的PAP17磷饥饿诱导表达似乎更为强烈。这些结果表明PAP17在白菜和甘蓝根部可能参与了根外磷的活化与吸收及无机磷由根部向其他组织器官的转运。     

拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1的克隆、表达和酶学特性

本研究克隆拟南芥硫代葡糖苷酶基因TGG1,利用毕氏酵母表达。重组蛋白用镍亲和柱纯化,获得高纯度芥子酶。重组蛋白分子量78 kD,与天然TGG1分子量接近,为糖基化蛋白。TGG1信号肽在酵母中具有分泌功能,约25%芥子酶分泌到培养基中。TGG1重组蛋白具有广泛的pH适应性,最适反应温度40℃左右。其活性被低浓度维生素C激活,被高浓度维生素C抑制。用Hanes plot方法计算TGG1重组蛋白以Sinigrin为底物时,Km为65μmol/L,最大反应速率Vmax=3.28μmol.min-1.mg-1。     

陆地棉GhSPL3基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 利用生物信息学结合RT-PCR技术从陆地棉中克隆出SPL转录因子,命名为GhSPL3,在GenBank的登录号为JN795132。该基因包含一个426 bp的ORF(开放阅读框),推测编码141个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSPL3包含一个典型的SBP结构域和一个核定位信号;进化树分析发现,GhSPL3与AtSPL3聚为一组,推测棉花GhSPL3和拟南芥AtSPL3在结构和功能上可能有着一定的相似性。亚细胞定位表明,GhSPL3定位于细胞核中,荧光定量RT-PCR结果表明,GhSPL3基因在棉花各组织中都有表达,但表达量不同。在花中表达量最高,其次是在顶芽和茎中的表达量,在根和叶中表达量较低。通过分析GhSPL3在顶芽的不同发育时期的表达量发现,GhSPL3在三片真叶展平时的顶芽中表达量最高,推测GhSPL3可能在花芽的分化、生长阶段的转变和花器官的形成上起着重要作用。     

亚洲棉和雷蒙德氏棉PEBP家族基因的鉴定及该家族基因在陆地棉组织中表达分析

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族广泛存在于真核生物中,在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。利用亚洲棉(Gossypium arboreum,A2)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)的基因组数据库,分别搜索到8个棉花PEBP同源基因,都包含4个外显子和3个内含子,编码的蛋白都存在PEBP家族的保守基序和关键氨基酸位点,表明二倍体棉花中至少存在8个PEBP家族基因。进化分析表明,8个PEBP基因分属于3个亚家族,含FLOWERING LOCUS T(FT)-like亚家族1个、TERMINAL FLOWER 1(TFL1)-like亚家族5个(包括3个TFL1和2个BFT)、MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)-like亚家族2个。实时荧光定量PCR分析陆地棉(Gossypium hirsutum)8个PEBP基因在根、茎、叶、幼苗顶端分生组织、花、胚珠和25 d的纤维组织中的表达,表明FT1在叶片中表达量最高,其次在纤维、胚珠和花中;MFT1在各组织中均表达,但在纤维中表达量最高,其次是花和叶片中,而MFT2以在叶片中表达为主;TFL1a、TFL1b和TFL1c均在根中表达量最高,但TFL1c在叶片、花和胚珠中也有相对较高的表达;BFT1和BFT2在叶片中表达量最高,但除幼苗顶端分生组织外,BFT1在其他各组织中的表达明显高于BFT2。这些结果表明,PEBP家族基因在棉花的生长发育中可能具有不同的功能。     

3个类核糖核酸基因在磷饥饿条件下的表达

核糖核酸酶（RNases）可以将衰老的植物组织中的核糖核酸降解释放出磷元素,使它能够运送到幼嫩部位被重新利用。许多核糖核酸酶基因的表达受磷饥饿的正调控。利用已有的EST序列,从普通小麦“小偃54”中分离了3个核糖核酸酶基因的cDNA序列。这3个基因预测的氨基酸序列与S-核糖核酸酶和S-like核糖核酸酶（类核糖核酸酶）的氨     

大豆Gm TIP1;1基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长, 经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性, 故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481), 该基因ORF长753 bp, 编码1个包含250个氨基酸的蛋白, 在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94 bp的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式; 系统进化树分析发现Gm TIP1;1聚类到豆科植物分支, 其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支, 推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据; 半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平, 暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用; 在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然保持较高的表达水平; 以pYES2为酵母表达载体, 转化酿酒酵母INVSc1菌株, 获得重组酵母INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1), 转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1 (pYES2), 而在干旱胁迫下则没有显著差异, 表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。