仔猪断奶前腹泻抗病基因育种技术的创建及应用

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4ac是引起仔猪断奶前腹泻最主要的细菌性病原,仔猪小肠上皮细胞有无ETECF4ac受体是仔猪被感染时是否发病的关键。任军等（2012）利用大规模资源家系群体和远缘群体,通过全基因组连锁定位分析、目的区域的重组断点事件分析和远缘群体高通量SNP标记的关联性分析等严谨的遗传学分析手段,确定了ETECF4ac受体基因为MUC13,     

仔猪产肠毒素大肠杆菌F4受体研究进展

猪肠毒素大肠杆菌F4(ETEC F4)是引起1～2周龄仔猪黄、白痢最普遍、危害最大的大肠杆菌。ETEC F4能否致病,决定于猪的小肠上皮细胞有无ETEC F4受体。本文综述了ETEC F4的黏附模式,F4特异受体在猪小肠中的分布,受体的生化特性,受体编码基因的定位、克隆现状及存在的问题,并对今后F4受体的研究方向及应用前景进行了展望。     

δ差异显示法筛选仔猪ETEC F4ad受体相关基因

初生仔猪泻痢的病原菌主要是肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4,仔猪小肠上皮细胞有无F4受体对于仔猪抗病性具有重要意义.本试验采用δ差异显示法筛选仔猪F4ad受体相关基因.将获得的δ条ESTs通过GenBank进行序列同源比对,发现其中1条与人糖基磷脂酰肌醇锚1(GPI 1)基因有91%同源性.表明该基因可作为F4ad受体候选基因进行进一步研究.     

仔猪产肠毒素大肠杆菌F4受体研究进展

仔猪腹泻是养猪生产中的一种常见病和多发病,也是困扰规模化养猪生产的主要难题之一。其中,产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是造成新生和断奶仔猪腹泻的最主要病原体。文章综述了产肠毒素大肠杆菌F4受体的数量性状基因座(QTL)定位、候选基因以及单核苷酸多态性(SNP)发现,并对今后F4受体研究的问题解决及系统验证进行了展望,以期为培育种猪抗腹泻病新品系奠定理论基础。     

仔猪断奶前腹泻抗病基因育种技术的创建及应用

产肠毒素大肠杆菌（ETEC）F4ac造成的断奶前仔猪腹泻病是养猪生产中的常见病,给世界养猪业造成了巨大经济损失。本研究面对这一现状,通过全基因组连锁定位分析、目的区域的重组断点事件分析和远缘群体高通量SNP标记的关联性分析等严谨的遗传学分析手段,确定了决定仔猪ETECF4ac腹泻易感性的基因为MUCl3基因,并发现了能准确鉴别易感个体和抗性个体的分子标记（准确率〉97％）,相关研究论文已分别发表于相关国际专业学术期刊,由此首次在国际上创建了离精准度的断奶前仔猪腹泻抗病育种新技术,并利用所创建的分子育种新技术进行大面积推广应用,实现了我国种猪遗传改良研究的重要自主创新。     

鸡致病性大肠杆菌菌毛分型的初步研究

以鸡致病性大肠杆菌F1菌毛特异性单抗1F4－1、2C3、3H3和F11菌毛特异性单抗FA1、FB11作为检测试剂，将111株已知O抗原的鸡致病性大肠杆菌经MD液体培养基连续传代培养后，通过直接玻板凝集法对各菌毛进行初步分型。结果发现F1、F11菌毛与O78、O1及O2三种优势O抗原型菌株之间存在较为明显的相关性，即致病性大肠杆菌主要集中在上。F1、F11菌毛在这三种O抗原型上的总检出率分别为95．6％、75．4％及73．3％。另外，在所检测的111株鸡致病性大肠杆菌中，只表达F1菌毛的大肠杆菌占菌杆总数的33．3％。只表达F11菌毛的大肠杆菌占菌株总数的8．1％，两者都表达的占菌株总数的36％，F1、F11菌毛的总检出率为78．3％。     

猪TLR5基因表达水平与F18大肠杆菌侵染关系分析

为了探究猪Toll样受体（Toll-like receptor 5,TLR5） 基因表达水平与F18大肠杆菌抗性的关系,试验通过不同血清型产肠毒素大肠杆菌（F18ab和F18ac）侵染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,同时通过脂多糖（LPS）分别诱导IPEC-J2细胞4和8 h,利用实时荧光定量PCR检测TLR5基因表达水平变化,并利用Western blotting进行蛋白表达分析。结果显示,不同血清型大肠杆菌（F18ab和F18ac）菌体侵染IPEC-J2细胞后,TLR5基因表达水平均极显著上调（P<0.01）;LPS诱导IPEC-J2细胞4和8 h后,TLR5基因表达水平均极显著上调（P<0.01）,且在LPS诱导IPEC-J2细胞8 h后,TLR5基因表达水平明显高于诱导4 h。与对照组相比,细胞中TLR5蛋白的表达水平极显著上调（P<0.01）,与LPS诱导及F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后mRNA表达水平结果相一致。本研究在细胞水平上分析了TLR5表达水平和F18大肠杆菌侵染的相关性,进一步证实猪TLR5基因的表达水平在细胞抵抗F18大肠杆菌的侵染过程中发挥了重要的调控作用,为今后关于TLR5基因功能及其在大肠杆菌腹泻遗传育种应用的研究奠定基础。     

猪TLR5基因表达水平与F18大肠杆菌侵染关系分析

为了探究猪Toll样受体(Toll-like receptor 5,TLR5)基因表达水平与F18大肠杆菌抗性的关系,试验通过不同血清型产肠毒素大肠杆菌(F18ab和F18ac)侵染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),同时通过脂多糖(LPS)分别诱导IPEC-J2细胞4和8h,利用实时荧光定量PCR检测TLR5基因表达水平变化,并利用Western blotting进行蛋白表达分析。结果显示,不同血清型大肠杆菌(F18ab和F18ac)菌体侵染IPEC-J2细胞后,TLR5基因表达水平均极显著上调(P0.01);LPS诱导IPEC-J2细胞4和8h后,TLR5基因表达水平均极显著上调(P0.01),且在LPS诱导IPEC-J2细胞8h后,TLR5基因表达水平明显高于诱导4h。与对照组相比,细胞中TLR5蛋白的表达水平极显著上调(P0.01),与LPS诱导及F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后mRNA表达水平结果相一致。本研究在细胞水平上分析了TLR5表达水平和F18大肠杆菌侵染的相关性,进一步证实猪TLR5基因的表达水平在细胞抵抗F18大肠杆菌的侵染过程中发挥了重要的调控作用,为今后关于TLR5基因功能及其在大肠杆菌腹泻遗传育种应用的研究奠定基础。     

F18大肠杆菌抗性型与敏感型苏太断奶仔猪十二指肠组织比较转录组分析

旨在揭示培育品种—苏太猪(杜洛克×梅山猪)F18大肠杆菌抗性的调控通路和重要候选基因,同时进一步探究中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控遗传基础的差异。本研究以课题组前期获得的苏太猪和梅山猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型断奶仔猪全同胞个体为研究对象,通过转录组测序筛选苏太猪F18大肠杆菌抗性相关的调控通路以及重要候选基因,并在细胞水平,利用qPCR和Western blot分析F18大肠杆菌刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后重要候选基因(蛋白)的表达变化,同时利用qPCR检测重要候选基因在苏太和梅山断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体十二指肠组织中的差异表达情况。结果显示:1)在苏太断奶仔猪F18大肠杆菌抗性型与敏感型个体中筛选出238个差异表达基因,主要参与Toll样受体信号通路(toll-like receptor signaling pathway)和糖脂类通路(glycosphingolipid biosynthesis-lacto and neolacto series),其中TLR5、IL-1β、FUT2为重要候选基因;2)不同血清型F18大肠杆菌(F18ac、F18ab)菌体分别刺激小肠上皮细胞IPEC-J2后,FUT2、IL-1β、TLR5基因mRNA表达水平显著上调(P0.05),并且其蛋白表达水平也表现为明显的上调,由此表明,TLR5、IL-1β和FUT2在断奶仔猪F18大肠杆菌感染过程中发挥重要的调控作用;3)组织差异表达分析显示,TLR5、IL-1β和FUT2在苏太猪抗性型与敏感型个体十二指肠组织中表达差异均达到显著水平(P0.05),而梅山猪中TLR5、IL-1β表达差异达到极显著水平(P0.01),FUT2表达水平差异不显著(P0.05)。结合课题组前期关于梅山猪及外来引进品种F18大肠杆菌抗性相关分子机制研究及报道,本研究进一步证明中外猪品种F18大肠杆菌抗性调控的遗传基础确实存在差异,Toll样受体信号通路及CD14、TLR5等基因可能在中国地方品种—梅山猪抵抗F18大肠杆菌感染过程中发挥着免疫调控作用,而鞘糖脂合成通路及FUT2等基因可能在外来猪品种F18大肠杆菌受体形成过程中起关键作用。     

大肠杆菌新型菌毛(F1987)的基因定位

对动物产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)的一种新型菌毛 (F1987)进行了相应基因的定位研究 ,通过对表达该新型菌毛 (F1987)相应 ETEC菌株的培养、质粒提取、对大肠杆菌受体菌株 DH5α的转化及阳性转化子筛选与相应菌毛表达的检定等 ,初步表明该新型菌毛 (F1987)的基因定位于质粒上     

F4大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪的体外鉴定研究

猪小肠上皮细胞表面的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)F4受体的基因型与其粘蛋白4(MUC4)基因密切相关,根据MUC4基因内含子7能否被限制性内切酶XbaⅠ酶切,可以在基因水平上将所检测的猪分为ETEC F4易感型纯合子SS,易感型杂合子SR和抵抗型RR。为筛选对ETEC F4受体易感性和抗性仔猪用于本实验室的后续实验,本实验利用MUC4基因的多态性,对送检猪的样品进行初步的分型检测。选取MUC4基因内含子7不同等位基因型的仔猪,分离其小肠上皮细胞,并分别与野生型F4ab、F4ac、F4ad大肠杆菌,表达fae操纵子的重组大肠杆菌r F4ab、r F4ac、r F4ad进行体外黏附和黏附抑制试验。研究结果表明,上述野生菌或重组菌对SS和SR两种基因型的4周龄断奶大白仔猪小肠上皮细胞均具有较好的黏附能力,而且经过抗F4单克隆抗体处理后的细胞,对细菌的黏附数明显下降。而RR型仔猪小肠上皮细胞不能黏附上述野生菌或重组菌。本研究为体外鉴定F4受体易感性仔猪,以及为进一步研究ETEC F4的致病机理奠定了基础和平台。     

抗鸡大肠杆菌F11菌毛单克隆抗体的研制

将充分菌毛化的大肠杆菌（C1976－79（pap )经4‰甲醛灭活作为免疫原免疫BALB／c小鼠，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接ELISA筛选获得FA1、FB11两株抗FB11菌毛单抗，其FLISA效价分别为18log2和15log2试管凝集价分别为8log2和6log2。免疫印迹实验表明：两株单抗均能与鸡大肠杆菌F11菌毛反应，识别分子量为18kD左右的菌毛蛋白。同时对猪病原性大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应。这表明F11菌毛是不同于K88、K99、987P、F41及F18等粘附素的一种大肠杆菌菌毛。     

一规模化猪场断奶仔猪腹泻大肠杆菌毒力因子的检测

从疑似断奶仔猪腹泻的仔猪中分离、鉴定出15株病原性大肠杆菌。经O血清型鉴定,11株为0131、4株未定型,所有O131血清型菌株呈β溶血。多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,O131菌株的毒素为STa、STb、SLT-2e,表达F18粘附素,未定型菌株的毒素为STa,共表达F6和F18粘附素。对15株大肠杆菌用16种抗生素进行药敏试验,结果表明:分离株对阿米卡星、痢特灵、新霉素敏感,而对多种抗生素产生了不同程度的耐药性。运用本场大肠杆菌分离株灭活苗免疫猪群,取得良好效果。     

富营养化对大肠杆菌耐药性及外膜蛋白OmpF表达水平的影响

为了研究水体富营养化对大肠杆菌耐药性与外膜蛋白Omp F表达水平之间的相关性,通过建立模型生态系统,分离纯化大肠杆菌进行药敏试验,并采用Western-Blot蛋白印迹法对耐药大肠杆菌Omp F的表达水平进行定量研究。结果显示:从低剂量组中不同时期分离的多株大肠杆菌对AMP、CF、TEL和CHL 4种抗生素同时表现为高水平耐药,表明大肠杆菌多重耐药的出现与系统环境富营养化有关;对5株耐药大肠杆菌及3株敏感大肠杆菌的Omp F表达水平定量分析显示,与空白组相比,耐药大肠杆菌的Omp F在第16天后显著下调并且维持到第68天,表明轻度富营养化导致大肠杆菌耐药的出现和维持可能与Omp F的减量表达有关。本研究结果为进一步开展富营养状态下大肠杆菌耐药性的形成和维持的研究提供了理论基础。     

猪TLR4基因在F18大肠杆菌抗性型和敏感型资源群体间的差异表达分析

本研究旨在检测TLR4基因mRNA在猪各个组织的分布以及在F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间差异表达水平,为探讨该基因在免疫识别和F18大肠杆菌抗性中发挥的作用提供理论依据。本试验运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术进行定量测定。首先,各取8头35日龄F18大肠杆菌抗性型和敏感型苏太仔猪组织样,包括心脏、肝脏、脾脏等11个组织,提取总RNA,以GAPDH基因为内参基因,进行实时荧光定量PCR。对TLR4基因mR-NA进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算TLR4基因mRNA在各个组织以及F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间表达量。结果显示,TLR4 mRNA在猪各种组织中广泛表达,在肺、淋巴结、肾脏和脾脏等免疫器官中表达量较高,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量普遍高于抗性型个体的表达量,在各个组织中(除胃外)TLR4表达量差异倍数从1.083到2.980不等;在肺、淋巴结、肾脏和胸腺组织中,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量显著高于抗性型个体的表达量(P<0.05)。本研究结果表明,TLR4基因通过天然免疫识别机制对猪F18大肠杆菌病等革兰氏阴性疾病有一定的影响,TLR4基因表达量...     

表达致PWD和ED保护性抗原重组菌的免疫效力

重组菌BL21（pFsFaeG）是能够同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原（F4、F18、Stx 2e）基因的基因工程重组菌。由IPTG诱导的重组菌制成抗原，经甲醛灭活后腹腔免疫小鼠，用间接ELISA法定期检测小鼠血清中的抗体产生情况，结果显示重组菌能够诱导小鼠产生针对上述3种保护性抗原的特异性抗体IgG。免疫攻毒保护试验表明，用大肠杆菌标准强毒株C83907（F4）、108／86（F18）和Stx 2e毒素攻毒后，重组菌诱导产生的抗体能够对小鼠提供80％以上的保护。     

基因工程苗预防仔猪大肠杆菌病效果分析

仔猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的传染病。在20世纪50年代以前,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病性的,到50年代以后,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有致病性。大肠杆菌血清型用O：K：H表示,一般使仔猪致病的血清型为肠产毒性大肠杆菌ETEC中的F4（K88）、F5（K99）、F8（987P）类大肠杆菌。     

抗仔猪断奶前腹泻猪专门化新品系的培育

利用江西农业大学获国家发明专利和国家技术发明二等奖的“仔猪断奶前腹泻(ETECF4ac)抗病基因育种技术”结合常规育种技术,历时6 年培育了BN101系、BN102 系和BN103 系3 个抗仔猪断奶前腹泻基因(MUC13 基因)抗性型(GG)纯合的瘦肉型抗仔猪断奶前大肠杆菌(ETEC)F4ac 腹泻猪专门化新品系。3 个新品系仔猪断奶前腹泻发生率均显著低于常规未经选育群体,且其生长、繁殖、产肉以及体型外貌等性状均表现优良,达100 kg 平均日龄分别为155.43 d、158.21 d 和159.27 d,100 kg 体重平均活体背膘厚分别为:8.96 mm、9.47 mm 和9.52 mm,经产母猪平均总产仔数分别为:10.43 头、12.31 头和12.79 头,料肉比分别为:2.38、2.44 和2.48,且变异系数都在10% 以下。这些专门化新品系的成功培育实现了我国抗病种猪培育的新突破。     

猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达

将猪肌生成抑制素编码序列下游883-l126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成l2个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F7、R3、R2、R1)，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F1长38bp，Rl长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NcoI和XhoI的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDl8—T载体连接，转化JMl09感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致，表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经NcoI和XhoI酶切，回收254bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL2l(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS—PAGE，检测出猪肌生成抑制素的表达。     

CD14基因在大白猪F18大肠杆菌病耐受型和敏感型个体间的差异表达分析

本研究旨在分析CD14基因在大白猪F18大肠杆菌耐受型和敏感型个体间的mRNA表达差异,以探讨CD14基因在断奶仔猪抗F18大肠杆菌中发挥的潜在作用。挑选大白猪耐受型和敏感型个体各4头,通过利用Real-time PCR方法比较分析CD14基因在个体各组织间的表达规律。结果表明:CD14基因在大白猪耐受型和敏感型个体各组织间的表达趋势有着高度的一致性,其中CD14基因在肝中呈现高水平表达,在肺、肾和淋巴结中呈现中度表达,而在其他组织中的表达水平都非常低,CD14基因在耐受型个体各组织间的表达水平几乎都高于敏感组,其中CD14基因表达量在空肠组织中差异达到极显著水平(P0.01)。由此推测,CD14基因对E.coli F18抗性的调节可能不是通过直接作为F18大肠杆菌的受体来实现,而是通过参与并调节机体的免疫反应来实现的,并且CD14基因的上调可能与F18大肠杆菌的抗性存在一定的联系。