野牦牛及青海地方牦牛品种全线粒体基因组母系遗传多样性、分化及系统发育分析

旨在从分子水平上探究野牦牛及青海地方牦牛品种的母系遗传多样性、群体遗传结构、亲缘关系和遗传背景。本研究在测定青海省4个地方牦牛品种(即青海高原、环湖、雪多和玉树牦牛)22条全线粒体基因组(Mitogenome)序列的基础上,从GenBank下载了已公布的野牦牛及上述4个地方牦牛品种的142条相应序列,使用BioEdit 7.2.5、Arlequin 3.11和Network 10.1等软件对共计164条线粒体基因组序列进行综合分析。结果显示：1)根据序列间核苷酸变异共确定了115种单倍型,其中野牦牛和青海地方牦牛品种分别拥有22种和93种单倍型;在野牦牛和青海高原、环湖、雪多、玉树牦牛中分别检测到22、26、18、23、19种特有的单倍型。遗传多样性分析显示,野牦牛单倍型多样度最高(0.992 8±0.014 4),且高于4个青海地方牦牛品种的单倍型多样度(0.973 1±0.007 7);4个青海地方牦牛品种单倍型多样度大小依次为：雪多牦牛(0.988 5±0.012 6)、玉树牦牛(0.975 8±0.018 7)、青海高原牦牛(0.973 0±0.016 6)和环湖牦牛(0.939 3±0.027 8)。2)野牦牛与环湖牦牛之间的固定分化指数值(F_ST值)最大(0.041 2),分化程度最高,而与玉树牦牛间的F_ST值最小(-0.008 8),分化程度最低。青海4个地方牦牛品种中,雪多牦牛与青海高原牦牛之间F_ST值最大(0.035 8),分化程度最高,而雪多牦牛与环湖牦牛间F_ST值最小(0.011 2),分化程度最低。3)聚类分析显示,4个青海地方牦牛品种各自为1类,存在明显的母系遗传差异。相比而言,环湖牦牛和雪多牦牛聚类较近,青海高原牦牛和玉树牦牛聚类较近,而野牦牛与玉树牦牛聚类关系更近,各品种(群体)间的聚类结果与其分化程度、地理分布一致。4)系统发育分析表明,115种单倍型分布在3个大的母系遗传分支(即Mt-Ⅰ、Mt-Ⅱ和Mt-Ⅲ),其中Mt-Ⅰ支系所占比例为72.17%,由A、B、E和F 4种单倍型组构成;Mt-Ⅱ支系包括C、D和H 3种单倍型组,占26.09%;而Mt-Ⅲ支系只包含G单倍型组,由雪多牦牛和野牦牛所拥有,所占比例为1.74%,提示牦牛有3个母系起源。综上所述,野牦牛和青海4个地方牦牛品种均具有丰富的母系遗传多样性,其多样性水平由高到低依次为野牦牛、雪多牦牛、玉树牦牛、青海高原牦牛和环湖牦牛。青海4个地方牦牛品种间及与野牦牛间的遗传分化程度均较弱,但各自拥有特有的母系遗传信息,存在明显的母系遗传差异。野牦牛和青海家牦牛品种由3个母系支系组成,推测牦牛有3个母系起源。     

玉树牦牛与四个牦牛群体线粒体DNA D-Loop区遗传多样性分析

利用线粒体DNA标记方法从分子水平上研究牦牛的遗传多样性。根据牦牛线粒体DNA(mtDNA)序列设计引物,扩增出长度为1 000 bp左右的片段,序列对比分析。结果表明:mtDNA D-Loop区长度为945 bp,共发现变异位点127个,单倍型71个,单倍型多样度(Hd)为0.909±0.016,核苷酸多样性(pi)为0.082;其中玉树牦牛发现变异位点74个,单倍型27个,单倍型多样度(Hd)为0.885±0.034,核苷酸多样性(pi)为0.0134;申扎牦牛单倍型多样度、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数均最高;5个牦牛群体D-Loop区序列具有一定的A/T碱基偏好性。玉树牦牛不遵循中性进化(P0.05),其余4个牦牛群体符合中性进化(P0.05);玉树牦牛与类乌齐牦牛和帕里牦牛的遗传距离较近(0.023、0.018),申扎牦牛与斯布牦牛的遗传距离最远(0.533)。发现玉树牦牛与其余4个群体的牦牛在同一个分支。斯布牦牛和申扎牦牛群体出现两个分支,说明玉树牦牛在进化的过程中可能不存在相互交流的情况。     

互助白牦牛与天祝白牦牛父系遗传差异分析

为探究青海省互助白牦牛与甘肃省天祝白牦牛间的父系遗传差异,试验使用5个Y-SNPs标记(SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3和OFD1Y10)和1个Y-STR标记(INRA189)对32头互助白牦牛和34头天祝白牦牛进行PCR扩增、测序和分型分析,使用BioEdit 7.2.5、Arlequin 3.11和Network 10.1等软件综合分析2个白牦牛品种(群体)的父系遗传多样性、群体结构、分化状况及遗传背景。结果表明：在2个白牦牛品种(群体)中共确定了5种Y染色体单倍型。其中,在互助白牦牛中共确定了4种Y染色体单倍型,即H1Y1、H10Y1、H11Y2和H12Y2;在天祝白牦牛中共确定了5种Y染色体单倍型,即H1Y1、H10Y1、H11Y2、H12Y2和H13Y2。互助白牦牛和天祝白牦牛Y染色体单倍型多样度分别为0.750 0±0.034 9和0.688 1±0.061 4。2个白牦牛品种(群体)间的固定分化指数值为0.018 6,无显著遗传分化(P>0.05)。2个白牦牛品种(群体)均由Y1、Y2两个父系支系(单倍型组)组成,天祝白牦牛以Y1支系(单倍型组,59%...     

新疆巴州牦牛种群线粒体DNA遗传多样性及其系统发育分析

研究测定新疆巴州牦牛种群线粒体DNA细胞色素b基因全长序列,在此基础上构建系统发育树,分析种群的遗传现状.结果表明,在17头巴州牦牛个体中检测到4种Cyt b基因单倍型,单倍型多样性为0.331,核苷酸多样性为0.00102;系统发育关系显示,巴州牦牛Cyt b基因单倍型明显有两个分支,一支与家牦牛单倍型聚在一起,另一支与新疆野牦牛单倍型聚在一起,表明巴州牦牛可能有2个母系起源.     

四川省不同类群牦牛遗传进化树构建

四川省是中国三大牦牛主产区之一,牦牛(Bos grunniens)广泛分布于川西北高原地区。本文扩增了四川4个地方类群牦牛的线粒体DLoop区637 bp的片段,与西藏、青海、新疆等地的地方类群,以及野牦牛进行进化关系分析。分析结果显示四川牦牛的单倍型多样性较为丰富,昌台牦牛在4个类群中具有最高的单倍型多样性(0.883±0.020)和核苷酸多样性(0.017 42±0.012 94)。进化树分析显示四川牦牛与其他地区牦牛分为明显的2个支系,昌台牦牛和金川牦牛与九龙牦牛、达日牦牛、大通牦牛、天祝牦牛、西藏牦牛、玉树牦牛具有较近遗传距离。本研究为四川地方牦牛地方类群的利用与开发提供了分子生物学依据。     

基于mtDNA D-loop序列探究门源白牦牛与天祝白牦牛间的遗传差异

为从分子水平上探究青海省门源白牦牛与甘肃省天祝白牦牛间的母系遗传差异,本研究对31头门源白牦牛mtDNA D-loop区部分序列进行测定,结合GenBank中已报道的235条天祝白牦牛相应序列,对共计266条白牦牛D-loop序列进行了综合分析。结果表明,在截取的638 bp白牦牛D-loop区分析序列中,排除64处插入或缺失后共检测到80个多态位点,包括5个单一多态位点和75个简约信息位点。根据序列间核苷酸变异共确定了56种单倍型,其中门源白牦牛拥有特有单倍型7种,天祝白牦牛包含特有单倍型43种,二者共享的单倍型只有2种。门源白牦牛单倍型只分布在A、B和C单倍型组中,而天祝白牦牛单倍型分布在A、B、C、D、E和F单倍型组中,并含有4种普通牛单倍型序列,提示天祝白牦牛中存在普通牛遗传渗入。门源白牦牛单倍型多样度为0.862,核苷酸多样度为0.007,而天祝白牦牛单倍型多样度为0.946,核苷酸多样度为0.014,表明天祝白牦牛的遗传多样性水平高于门源白牦牛。门源白牦牛与天祝白牦牛间的遗传分化指数(Fst)为0.114,表明2个品种(群体)间呈中等分化水平。系统发育分析结果显示,56种单倍型可分为2个明显的分支(即Ⅰ和Ⅱ),表明白牦牛有2个母系起源。综上所述,天祝白牦牛的遗传多样性水平高于门源白牦牛,门源白牦牛母系遗传多样性较低;2个品种(群体)间呈中等遗传分化水平,天祝白牦牛存在一定程度的普通牛基因渗入;2个品种(群体)均由2个母系支系组成,提示白牦牛有2个母系起源。鉴于2个品种(群体)间呈中等遗传分化水平,且都拥有特有的单倍型遗传信息,故建议将其均作为独立的"遗传单元"进行遗传资源保护进而开展保种和选育实践。     

中甸牦牛mtDNA ND6和COⅢ基因遗传多样性及系统进化分析

为了解中甸牦牛的遗传多样性,使其遗传资源能够得到合理开发利用,本研究对中甸牦牛15个个体mtDNA ND6基因和COⅢ基因全序列进行测定,使用MEGA5.0、DNASP5.0、Clustal X1.83等软件分析了核苷酸多样性、单倍型多样性等遗传多样性指标。结果表明:(1)中甸牦牛ND6基因全序列长528bp,4种核苷酸T、A、G、C的平均含量为20.8%、42.2%、7.6%、29.4%,存在一定的碱基组成偏倚性;COⅢ基因全序列长度为781bp,4种核苷酸T、A、G、C的平均比例为29.2%、26.1%、15.2%、29.5%。(2)在15个中甸牦牛个体的ND6基因序列中均未发现单倍型及变异位点,表明中甸牦牛mtDNA ND6基因的遗传多样性较为贫乏;在COⅢ基因序列中发现了3个单倍型,4个变异位点,其中2个转换,2个颠换。(3)在构建的系统进化树中,中甸牦牛首先与麦洼牦牛等家牦牛聚为一类,说明其属于家牦牛,其次与野牦牛聚为一类,说明中甸牦牛与野牦牛亲缘关系较近;由遗传距离分析可知,中甸牦牛与野牦牛距离最小,与亚洲水牛距离最大。此结果进一步支持了将牦牛和野牦牛划分为牛亚科牦牛属的观点。     

西藏牦牛mtDNA-Cytb及ZFY基因遗传多样性与系统进化分析

为进一步了解西藏牦牛的遗传多样性及系统进化关系,通过对申扎、斯布、类乌齐和帕里4个西藏牦牛类群的mtDNA-Cytb基因及ZFY基因部分序列进行克隆及序列分析。结果表明:(1)西藏牦牛Cytb基因全长1 140 bp,共发现SNP位点13个,核苷酸多样性(Pi)为0.00315, Tajima's D值为0.41410(P0.10),共检出7种单倍型,单倍型多样性(Hd)为0.709;(2)ZFY基因第11外显子长596 bp,筛查出SNP位点22个,Tajima's D值为0.78287(P0.10),发现3种单倍型,核苷酸多样性和单倍型多样性分别为0.001066和0.2976;(3)聚类分析及核苷酸同源性分析显示,西藏牦牛与家牦牛的核苷酸同源性最高,与美洲野牛及欧洲野牛的核苷酸同源性次之,与水牛及非洲水牛的核苷酸同源性最低。研究结果表明,西藏牦牛遗传多样性较丰富,进一步支持将西藏牦牛及家牦牛划为牛亚科中独立牦牛属的观点,及牦牛的原始祖先来自于亚欧大陆东北部的观点。     

青海省格尔木牦牛的母系遗传多样性及支系组成

[目的]从分子水平上探究青海省格尔木牦牛的母系遗传多样性、群体遗传结构及其遗传背景。[方法]对49头格尔木牦牛mtDNA D-loop区部分序列进行了测定,后使用DnaSP 5.10.01、Arlequin 3.11和MEGA 5.05等生物信息学软件确定其多态位点和单倍型数目,计算核苷酸多样度和单倍型多样度大小,并进行系统发育分析。[结果]在截取的618 bp格尔木牦牛D-loop区分析序列中,排除1处插入(缺失)后共检测到45处多态位点,包括10处单一多态位点和35处简约信息位点;根据序列间核苷酸变异共确定了18种单倍型,其中单倍型H4为优势单倍型,核苷酸多样度为0.015±0.008,单倍型多样度为0.911±0.022。与野牦牛及大通、天祝、金川等其他家牦牛品种相比,格尔木牦牛群体单倍型多样度和核苷酸多样度值均较高,表明该群体具有丰富的母系遗传多样性。以美洲野牛为外群,邻接法(即NJ法)构建的系统发育树结果显示：格尔木牦牛群体18种单倍型分布在A、B、C、D和G 5种单倍型组中,且聚为3个大的分支,提示格尔木牦牛由3个母系支系组成,拥有3个母系起源。[结论]格尔木牦牛群体具有丰...     

天祝白牦牛和甘南牦牛DRB3基因外显子2多态性研究

试验通过对天祝白牦牛和甘南牦牛DRB3基因外显子2部分CDS序列进行分析,获得其准确单倍型,通过直接测序与聚合酶链式扩增阻碍突变系统(ARMS)扩增法获得干净的单链,对高度杂合的双链进行分型。结果发现65个SNPs,1个密码子的插入缺失,获得30个单倍型,其中有7个单倍型是首次发现,应该是天祝白牦牛和甘南牦牛特有的单倍型。通过对已知牛属所有DRB3基因外显子2单倍型与本研究发现的单倍型进行分析发现天祝白牦牛和甘南牦牛分享普通牛和瘤牛单倍型,可能有普通黄牛和瘤牛的遗传背景,且DRB3基因外显子2的4、25、30、53、59、62、63、66、78氨基酸位点受到了正选择的影响,主要发生在天祝白牦牛群体里,这与天祝白牦牛长期选育白毛有一定的关系。     

鸡血中血红素的提取

用醋酸钠作沉淀剂，从鸡血中提取血红素的最佳操作条件为：抽提时ｐＨ３．０，沉淀时ｐＨ５．０，醋酸钠使用量１．２％，酸性丙酮、水和氯仿使用量分别为血液体积的３．０倍、１．２倍和３．０倍。     

酶法水解牦牛血红蛋白的试验研究

对牦牛血液中血红蛋白的碱性蛋白酶水解制取工艺进行了研究,采用L9(34)正交实验确定了最佳酶解条件,实验结果表明:加酶量5%、酶解pH 8、酶解温度55℃、酶解6h,100mL牦牛血细胞可得血红蛋白粉32.17g。     

正交试验法优化速派颗粒中牡丹皮活性成分提取工艺

目的:优化速派颗粒中牡丹皮活性成分的提取工艺。方法:以芍药苷和丹皮酚为指标,通过正交试验考察不同因素和水平对提取工艺的影响。结果:芍药苷的最佳提取工艺是70%乙醇、提取温度80℃、乙醇用量12倍、提取时间0.5 h;丹皮酚的最佳提取工艺是蒸馏时间为4 h、收集8倍液量、0℃冷藏36 h。结论:该提取工艺合理、可行,可为大生产提供实验依据。     

导入野血牦牛群体的遗传变异和基因分化

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法和火焰光度法对家牦牛和３个含野血牦牛群体ＴＦ,ＨＢ,Ｈｐ,ＫＥ,ＡＭＹ１和ＲＢＣＬＤＨ１６个基因座多态性的研究表明：家牦牛与３个含野血牦牛群体具有同样的多态性特征,但群体的遗传变异随野牦牛血比例的增多而减少。含野血牦牛群体之间的亲缘关系大于家牦牛,再大于野牦牛,但总群体所发生的基因分化程度很小（２７４８％）。     

血红素的应用与提取方法

血红素是血红蛋白、肌红蛋白等的辅基,具有重要的生理功能,在医药、食品等方面得到广泛应用。论文介绍了血红素的冰醋酸提取法,酸性丙酮提取法、羧甲基纤维素提取法、酶解提取法、血粉提取法、有机酸和有机碱混合提取法。     

导入外血对本地牦牛复壮的效果分析

为了有效地防止当地耗牛退化,提高耗牛生产性能,通过导入外血对本地牦牛进行复壮,结果表明:同等条件下导入外血组犊牛生长发育明显加快,抵抗力加强、成活率、畸形率都有很大的提高,可以达到复壮耗牛群体的目的。     

高分辨率熔解曲线分析法检测牦牛脂蛋白脂酶外显子7的多态性及与生长性状相关性分析

脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是一个分子质量为54 kb的糖蛋白,其活性受营养因素、激素水平等调节,因牦牛生存环境的特殊性,试验拟从分子水平研究天峻县牦牛脂蛋白脂酶外显子7(LPL-Exon7)基因的多态性,并与生长发育性状进行关联分析,从而为牦牛营养调控、品种资源保护和遗传育种提供科学理论依据。试验采集青海省海西州天峻县牦牛抗凝血106份,提取血样DNA,并利用PCR技术和高分辨率熔解曲线分析法对候选基因LPL-Exon7进行多态性分析,并于采血的同时对牦牛体重、体斜长、体高、胸围和管围等生长性状指标进行了相关性和遗传效应分析。结果表明,高原牦牛LPL-Exon7基因在高原牦牛和野血牦牛中都表现为多态,存在3种基因型,即AA、AB和BB,由1对等位基因A和B控制,A等位基因均为优势等位基因。经χ²检验,符合哈迪—温伯格(Hardy-Weinberg)定律,处于平衡状态(P>0.05)。该位点在高原牦牛和野血牦牛群体中公、母牦牛的多态信息含量为0.3588和0.2103、0.3219和0.3343,高原牦牛母牛的多态信息含量PIC<0.25,处于低度多态,高原牦牛公牛和野血牦牛公、母牛的多态信息含量均在0.250.05)。因此,初步推断牦牛LPL-Exon7可以作为牦牛标记辅助选择的遗传标记之一。     

低海拔异地育肥牦牛与本地杂交肉牛(秦川×西门塔尔)在不同非蛋白氮水平饲粮条件下血液生理生化指标及生长性能的差异

为探究异地育肥牦牛模式,本试验对比了低海拔异地育肥耗牛与本地杂交肉牛(秦川×西门塔尔)在同等条件下血液生理生化指标和生长性能的差异。将体重相近的8头1岁本地杂交肉牛(秦川×西门塔尔)和8头4岁青海牦牛各分为2组,每组4头,同一品种的2组试验牛分别饲喂低非蛋白氮饲粮[LNPN,饲粮中缓释尿素添加量为1.0%(干物质基础)]和高非蛋白氮饲粮[HNPN,饲粮中缓释尿素添加量为1.5%(干物质基础)]。预试期10 d,正试期50 d。结果发现:牦牛与肉牛均在LNPN条件下表现出最高的平均日采食量和最小的料重比。饲粮非蛋白氮水平未对牦牛与肉牛的血常规指标造成显著影响(P0.05),但是牦牛在各饲粮条件下中性粒细胞数目(Gran#)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、红细胞分布宽度标准差(RDW-SD)、平均血小板体积(MPV)和血小板分布宽度(PDW)显著高于肉牛(P0.05),而平均红细胞血红蛋白浓度(M CHC)和血小板数目(PLT)显著低于肉牛(P0.05)。饲粮非蛋白氮水平未对肉牛和牦牛各项血清生化指标产生显著影响(P0.05)。牦牛在各饲粮条件下血清总蛋白(TP)、尿素氮(UN)、肌酐(GREA)、免疫球蛋白A(Ig A)、免疫球蛋白M(Ig M)和免疫球蛋白G(Ig G)水平均显著高于肉牛(P0.05)。牦牛在HNPN条件下的血清白蛋白(ALB)水平显著低于LNPN条件下(P0.05)。本试验结果表明,在肉牛和牦牛育肥饲粮中添加1.0%的缓释尿素替代饲粮蛋白质是可行的;低海拔异地育肥牦牛不会对牦牛健康产生不利影响。     

秦川牛血红素提取工艺的研究

以秦川牛血为原料提取血红素,选择影响提取的主要因素——氯仿加入量、酸性丙酮加入量、pH分别作为单因素进行梯度试验,确定其合适范围,进一步通过正交试验选取最佳提取条件。结果表明,提取血红素的最佳工艺为氯仿加入量为血溶体积的5倍,酸性丙酮加入量为血球蛋白滤液的5倍,调节pH4～5。     

肃南县牦牛导入青海大通牛场野牦牛血液复壮效果调查

[目的]通过引进野血种公牦牛改良当地牦牛可有效遏止牦牛退化,进一步巩固和改善我县牦牛品种质量,恢复其原有的优良生产性能和品种特征,提高经济效益.[方法]本文以野牦牛和家牦牛杂交后代与家牦牛后代为研究对象,分别测定了杂种牦牛和家牦牛的初生、6月龄、18月龄体尺、体重.[结果]显示,在同等条件下,1/4野血牦牛初生、6月龄、18月龄体尺、体重均显著高于同龄家牦牛,经t检验差异极显著（P＜0.01）.[结论]用野血牦牛改良家牦牛,是目前更新复壮家牦牛群体的有效途径之一,能获得很强的杂种优势,对提高经济效益,增加农牧民收入,保护生态环境都具有十分重要的意义.