小鼠极体重建卵母细胞的体外受精与发育

本实验分别以昆明系、ICR系和C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb系小鼠（即转绿色荧光蛋白基因小鼠,简称荧光标记小鼠）为主要试验动物,探索其卵母细胞第一极体核重组卵母细胞的生殖功能。超数排卵后采集小鼠卵丘卵母细胞复合体（COCs）,利用链霉蛋白酶酶解法分离出第一极体（PbI）;以形态学和台盼蓝染色相结合的方法对不同温度保存条件下COCs中PbI进行活力鉴定和分级;采用显微操作术将PbI核供体注射到去核卵母细胞中,卵母细胞,进一步观察重建卵母细胞体外受精和体外培养发育能力。结果表明：注射hCG后12～14h回收的PbI活力最佳, 4℃条件下保存48h 后PbI仍保持活性;117枚昆明系和ICR系小鼠重建卵母细胞经体外受精获得13枚2-细胞胚胎, 38枚荧光标记小鼠的卵母细胞中有3枚卵裂成2-细胞胚胎。本研究初步证明小鼠第一极体重建卵母细胞可持续随后受精及其早期发育过程,为发掘和利用其它哺乳动物母本基因资源提供了参考依据。     

哺乳动物第一和第二极体的研究

卵母细胞在减数分裂过程中相继排出第一和第二极体,这些极体内的染色体和留细胞内的染色体同样具有遗传和生殖潜力,可用作生产有生殖能力的后代。因此,从理论上讲用一个卵母细胞的染色体可能繁殖出４个子代。     

猪卵母细胞第1极体的分离与保存

通过对屠宰场废弃的猪卵巢卵母细胞进行体外成熟培养(IVM)获得成熟卵母细胞,对体外培养成熟卵母细胞第1极体(Pb1)排出、活性及其形态学进行了统计分析;分别采用酶消化和显微操作两种方法进行了Pb1分离与采集,继而进一步结合台盼蓝细胞染色法,探讨了不同温度保存条件下Pb1存活情况.结果表明:卵泡卵母细胞IVM 40 h后发现大量高活性Pb1;显微操作分离极体效果显著优于酶消化法,且分离的Pb1活力高,完整性好.39℃条件下大多数采集的Pb1存活时间仅有4h,4℃条件下保存40 h存活率可达85.0%;-20℃保存1周达95.0%,而超低温-196℃冷冻保存1个月存活率和形态正常率分别达89.1%和97.8%.     

蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外发育的影响

为了探讨蛋白质添加剂对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养的影响，通过２３３８个卵母细胞，按２×２×２设计方法进行试验，即在体外成熟、体外受精及早期胚胎体外培养三个阶段的培养液中，添加与不添加蛋白质物质（体外成熟与体外培养为发情母牛血清，体外受精为牛血清白蛋白）。试验结果表明，在体外成熟阶段的培养液中，有无发情牛血清对牛卵母细胞的核成熟无显著影响（有血清组为８９％，无血清组为９０％）。但在体外受精阶段，受精液中含有牛血清蛋白质处理组的卵母细胞受精后，分裂率显著地高于无血清蛋白质组（Ｐ＜０．０１，８４％ｖｓ７２％）。同样，在早期胚胎体外培养阶段，含有发情牛血清的培养液大大促进早期胚胎的发育，与无血清组比较，其差异性极显著（Ｐ＜０．０１，３５％ｖｓ２１％）。同时，含血清组的胚胎孵化率亦显著地高于无血清组（Ｐ＜０．０１，６９％ｖｓ４７％）。本研究表明，蛋白质添加剂在ＩＶＦ和ＩＶＣ阶段是必需的，而在ＩＶＭ阶段则不甚重要。     

不同发情周期阶段和不同体积卵泡的卵母细胞对体外受精及其发育的影响

根据母牛卵巢黄体发育状态将实验用卵巢相应地划分为早期黄体(ELP)、功能黄体(LP)和退化黄体(LLP)三个试验组(实验1);实验2则按实验卵巢上卵泡的表面直径大小划分为小于2mm,2～6mm 和大于6mm 三组.采用注射器抽取法采集卵泡里的卵母细胞,然后按 Lu 等报导的方法进行体外成熟培养和体外受精。受精卵继续在体外条件下培养到囊胚阶段。实验2还进一步观察了囊胚体外发育到孵化囊胚的比率。结果表明,来自不同发情周期阶段的牛卵母细胞,经体外成熟培养后,各组体外受精分裂率(74.3%～78.4%)及体外囊胚发育率(27.7%～31.3%)均无显著差异;而来自表面直径小于2mm 卵泡的卵母细胞,其体外受精分裂率和体外囊胚发育率均显著地低于2～6mm 及大于6mm 组(P<0.01);来自直径大于6mm 卵泡的卵母细胞受精后的早期胚胎体外囊胚发育率均显著高于其余两组(p<0.01)。表明卵泡及其卵母细胞在体内的发育程度对其后体外受精及早期胚胎进一步发育的能力只有一定的影响。     

小鼠卵母细胞去核方法的改进

为摸索一种简单有效的小鼠(Mus musculus)卵母细胞去核方法,本研究对压电脉冲装置(Piezo)辅助显微操作条件下的小鼠中期Ⅱ(metaphaseⅡ,MⅡ)卵母细胞去核方法进行了改进,比较了改进的去核方法和常规去核方法,在无蔗糖或含蔗糖去核操作液中的去核效果及核移植重构胚的后续发育能力;用改进的去核法在无蔗糖的去核操作液中对卵母细胞进行去核,比较卵母细胞去核操作液及核移植操作液中添加不同浓度胎牛血清(FBS)时核移植重构胚的后续发育能力。结果显示,MⅡ期卵母细胞在无蔗糖和含3%蔗糖的去核操作液中通过调整显微镜物镜距离显示MⅡ期纺锤体区域的方法进行显核,显核率分别为98.4%(184/187)和98.7%(153/155)(P0.05)。在无蔗糖或含蔗糖的去核操作液中,用改进的去核法,即去核针穿过透明带后,紧贴MⅡ期纺锤体区域的质膜,施加负压将MⅡ期纺锤体区域吸住并将其直接拉出卵母细胞,去核率分别为84.6%和88.2%;用常规去核法在这2种去核操作液中去核,去核率分别为83.1%和88.6%,各组之间差异均不显著(P0.05);用改进的去核法比常规去核法吸出的胞质少。用改进的去核方法在无蔗糖的去核操作液中去核后,构建的核移植重构胚发育到8-细胞、桑椹胚和囊胚的比率最高,桑椹胚发育率(16.3%)和囊胚发育率(5.8%)显著高于用该法在含蔗糖的去核操作液中去核组(5.1%和0)。用常规去核法在无蔗糖操作液及含蔗糖操作液中去核后,核移植重构胚的桑椹胚发育率分别为3.3%和1.2%(P0.05),且均未获得囊胚发育。去核操作液和核移植操作液中添加20%FBS时,重构胚囊胚发育率显著高于添加10%FBS组(10.9%对4.9%)(P0.05),表明用改进的去核方法在添加20%胎牛血清(FBS)的操作液中进行去核及核移植操作是可行的,而且对重构胚后续发育的支持能力较好。本研究为进一步提高小鼠体细胞核移植效率做出了有益的探索。     

β－转换生长因子对牛体外受精卵体外发育的影响

本研究主要检测ＴＧＦ－β对牛早期胚胎体外发育和移植后的成活率的影响。在试验１和试验２，添加０．３～７．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β至无论是复杂培养液还是各成分已知的简单培养液中，囊胚中内细胞团细胞都不同程度地增长，比对照组的囊胚多０．５～１．０倍；此外在含有３．０～５．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β的培养液中的囊胚，其孵化率显著地高于对照组。在试验３中，添加３．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β显著地促进与不同细胞共同培养的囊胚内细胞团的细胞增长，在颗粒细胞或输卵管细胞及其两者组合当中的单层细胞上的囊胚表现突出。在试验４中，用ＴＧＦ－β培养所获得的囊胚移植于受体母牛，约４５～９０ｄ将受体屠宰检查中发现，ＴＧＦ－β的囊胚成活率高于无ＴＧＦ－β的囊胚．试验结果表明，ＴＧＦ－β可促进体外发育的囊胚内细胞团的细胞增长以及提高囊胚移植后的成活率。     

季节对体外成熟卵母细胞的发育能力的影响

猪的卵母细胞对外界环境非常敏感,造成猪的胚胎学相关研究是家畜繁殖学研究领域中最困难的方面之一。猪卵脆弱的主要原因是其胞质中含有大量的脂肪滴,但目前其具体生物学功能还不清楚。众所周知,猪的繁殖表现和环境密切相关,例如,温度、湿度、光照等。本研究目的是描述季节的变化对体外成熟卵母细胞发育能力的影响。连续两年从当地屠宰场获取初情期前猪卵巢,抽取猪卵丘卵母细胞复合体,并在不含BSA的NCSU-23(添加10 ng/mL EGF,10 ng/mL leptin,0.57 mm o l/L cysteine,10 IU/mL PM SG和10 IU/mL hCG)中培养44 h,然后用透明质酸酶脱去卵丘。部分卵母细胞经过电击进行孤雌激活,部分卵母细胞用来进行体细胞核移植。对于猪体细胞核移植,使用长白猪胎儿成纤维细胞做为核供体,上述脱去卵丘的卵母细胞作为胞质供体。克隆胚和孤雌胚在添加4 m g/mL的BSA液滴中培养,第2天和第6天分别计算卵裂和囊胚率(D 0:融合或激活的当天)。其中每个实验至少重复3次,所有实验都经过SPSS(13.0)统计分析。比较了不同季节每对卵巢获得A级卵(外包3层以上致密的卵丘细胞并且卵胞质均匀的卵母细胞为A级卵)和B级卵(外包2~3层卵丘细胞并且胞质均匀的卵母细胞为B级卵)的数量以及卵母细胞核成熟的比例(实验1),统计分析了不同季节孤雌(实验2)和核移植(实验3)胚胎发育能力的差异。实验1中发现春季(3~5月)COC s/ovary pairs的比例最高[7.6±3.5(春)vs 6.4±3.3(夏),6.7±2.9(秋),6.7±3.4(冬),P<0.05]。然而,没有发现卵母细胞的MⅡ百分比有显著性差异[75.3%±3.3%(春),73.5%±2.3%(夏),73.0%±4.2%(秋),76.5%±6.7%(冬),P<0.05]。实验2中观察到夏季孤雌胚胎的囊胚率显著性降低[10.2%±2.7%(春)vs 27.2%±3.5%(夏),24.2%±3.2%(秋),22.3%±3.4%(冬),P<0.05]。实验3,猪体细胞克隆胚胎在春季囊胚率获得提高[12.2%±1.3%(春)vs 10.3±1.1%(秋),8.1±1.4%(冬),P<0.05]。以上结果表明,季节变化影响体外成熟卵母细胞的发育能力。     

小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2磷酸化的变化

通过Western杂交检测了小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2的磷酸化变化情况。用抗p34^cdc2C末端抗体的杂交结果显示，小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2表现为上、中、下三条带，其中中带在培养4h出现，并持续增加直到培养16h,在20h有一个下降趋势并在培养24h又回升；上带从0－16h表现为持续下降趋势，20h稍回升后24h又下降；下带在整个培养过程中表现平稳。用特异性识别p34^cdc2去磷酸化的Tyr-15和Thr-14的抗p34^cdc2N末端抗体杂交结果，证明中带为p34^cdc2在Tyr-15和Thr-14上去磷酸化的形式。     

小鼠卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响

本实验通过牛生发泡(GV)期无卵丘细胞卵母细胞-裸卵(denuded oocytes,DOs)与小鼠卵丘细胞(mouse cumulus cells,mCCs)共培养,研究异种mCCs对牛DOs体外成熟和孤雌激活后发育的影响,进而探讨卵丘细胞对卵母细胞的作用机制,为牛卵母细胞体外成熟效率提高提供实验依据.牛卵母细胞分为COCs(cumulus-oocytes complexes)组、DOs+bCCs(bovine cumulus cells,bCCs)组、DOs+mCCs组和DOs组4个组合,体外成熟22～24h后,检测各组卵母细胞第一极体排出率、MⅡ期卯母细胞中谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量利孤雌激活后的发育能力,以及卵母细胞内骨形态发生蛋白15( BMP15和生长分化因子9(GDF9)mRNA相对表达水平.结果表明:(1) DOs+mCCs组和DOs+bCCs组卵母细胞核成熟率[(68.48±5.71)％,(71.00±4.27)％]显著低于COCs组(84.70±3.41)％(P＜0.05),但均显著高丁DOs组(54.26±5.03)％(P＜0.05); (2) DOs+mCCs组MⅡ卵母细胞GSH含量和孤雌激活囊胚率[(2.48±0.24) pmol/oocyte,(44.19±4.03)％]与DOs+bCCs组[(2.49±0.18)pmol/oocyte,(48.57±5.20)％]和DOs组[(2.40±0.17)pmol/oocyte,(43.47±7.34)％]之间没有差异,但分别显著低于COCs组[(9.67 ±0.18)pmol/oocyte,(59.93±6.13)％](P＜0.05),各组孤雌激活卵裂率之间没有显著差异[(98.85±4.32)％,(92.11±2.00)％,(95.40±4.11)％,(93.18±3.19)％](P＞0.05);(3)DOs+mCCs组、DOs+bCCs组和COCs组卵母细胞中BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平均显著性高于DOs组(P＜0.05),其中,DOs+mCCs组和COCs组GDF9 mRNA相对表达水平显著高于DOs+bCCs组(P＜0.05).实验结果表明,mCCs能提高牛DOs的核成熟率及BMP15和GDF9 mRNA相对表达水平,但对牛DOs的细胞质成熟和MⅡ卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚发育没有促进作用,说明卵丘细胞通过一些旁分泌因子促进卵母细胞核成熟,且这些因子的作用可能没有种属特异性.     

山羊卵母细胞无血清体外成熟培养

为研究无血清培养系统对山羊卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎早期发育力的影响,分别以0.3%牛血清蛋白(BSA)(mV)、1%聚乙烯醇(PVA)(mV)和1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(ITS)(VV)代替成熟培养液中胎牛血清(FBS),以添加5?S的OM为对照组,对来源于屠宰场的卵巢卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。成熟率PVA添加组(50.00%)显著低于FBS组(83.23%)(P<0.01)、BSA组(71.19%)和ITS组(76.79%),与FBS组无显著差异(P>0.05);成熟卵母细胞用离子霉素联合6-DMAP激活,在SOFaa中进行孤雌胚培养,BSA、PVA、ITS及FBS各组的卵裂率依次为61.90%、46.97%、79.07%和83.58%,囊胚率分别为25.00%、19.70%、55.81%和60.45%。结果表明:在OM基础培养液中添加BSA或PVA,卵母细胞的成熟率明显低于添加FBS,且卵裂率和囊胚发育率也低于对照组(P<0.05或P<0.01);添加ITS,卵母细胞成熟率虽低于对照组,但孤雌胚卵裂率和囊胚发育率与对照组接近(P>0.05)。表明以ITS代替FBS,可用于山羊卵母细胞体外成熟培养。     

超表达线粒体融合蛋白2基因(Mfn2)抑制小鼠卵母细胞体外成熟

线粒体融合蛋白2基因(mitofusin2,Mfn2)参与细胞凋亡和细胞周期调控,在卵母细胞和胎盘发育中起着重要作用.本研究旨在探讨Mfn2基因对小鼠(Mus musculus)卵母细胞体外成熟过程的影响.从小鼠卵巢中克隆Mfn2基因并构建pMfn2-Venus真核表达载体.经脂质体2000介导重组质粒pMfn2-Venus转染293T细胞(病毒包装细胞),确认重组质粒在293T细胞内的表达及定位.将pMfn2-Venus体外转录为cRNA,并注射入小鼠卵细胞中,进行体外成熟培养,并统计卵母细胞生发泡破裂(germinalvesiclebreakdown,GVBD)发生率以及第一极体(first polarbody,PB1)排出率,荧光显微镜下观察其表达及定位.结果显示,注射了Mfn2-Venus cRNA的卵母细胞,其GVBD发生率以及PB1排出率与对照组相比显著降低(P＜0.0001,P＜0.05).本研究首次揭示了Mfn2基因对小鼠卵母细胞体外成熟过程的影响,为卵母细胞体外成熟的研究提供了一个新方向,同时也为研究减数分裂过程中Mfn2基因提供了一个平台.     

山羊卵母细胞的显微受精及胚胎培养

采用胞质内精子注射（ICSI）构建山羊显微受精胚，在两种培养液（CR1aa和SOFaa）与颗粒细胞共培养条件下，分别添加不同浓度的牛卵泡液（BFF）和胎牛血清（FBS），研究其对山羊卵母细胞显微受精胚体外发育的影响。结果表明：①在CR1aa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率最高（22．2％），显著高于添加5％（13．1％）和15％（2．7％）组。②在SOFaa培养液与颗粒细胞共培养条件下，添加10％BFF的ICSI胚的囊胚发育率（25．1％）显著高于添加5％（12．9％）和15％（3．0％）组。③在两种培养液中，分别添加10％BFF和10％FBS，ICSI胚的囊胚率分别为22．6％和26．9，5．8％和6．1％。表明：CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜山羊的1CSI胚体外培养；在早期胚胎培养中，添加10％BFF可显著提高ICSI胚的囊胚发育率：添加10％BFF比添加10％FBS对提高早期胚胎培养质量更为有效。     

牛性控精子体外受精及受精卵的体外培养

为提高牛性别分离精子体外受精的效率,比较精卵共孵育8和22 h受精卵的体外发育能力,使用G- 1/G-2序贯培养液和SOFaa培养液培养牛性控受精卵,筛选出一种适合牛性控胚胎体外培养的培养液.精卵共孵育22和8h,牛性控受精卵的卵裂率分别为(55.9±4.52)％和(50.88±4.44)％,囊胚发育率分别为(35.05±5.02)％和(41.16±5.12)％,差异均不显著(P＞0.05);精卵共孵育8h组的囊胚孵化率(52.56±6.95)％显著高于22h组(39.81±6.38)％(P＜0.05).用SOFaa和G-1/G-2培养牛性控受精卵,其体外发育率无显著差异.但G-1/G-2液中受精卵发育到第7天时囊胚内细胞数(113.9±9.46)显著高于SOFaa组(102.0±9.97)(P＜0.05).性控精子与卵子共孵育8h可提高牛性控受精卵的囊胚孵化率,G-1/G-2培养液更利于牛性控受精卵的体外培养.     

小鼠卵母细胞去核方案的优化

为了优化小鼠卵母细胞去核方案，本研究对比了透明带磨口刺入和透明带直接刺入两种去核方法（分别简称磨口法和刺入法）、蔗糖处理与否、CB的浓度及去核针内径对小鼠卵母细胞的去核效率的影响，及CB浓度对去除部分胞质（不去核）的孤雌胚早期发育的影响。结果：（1）无论是磨口法还是刺入法，添加3％蔗糖和对照组之间的去核成功率及去核操作时间差异均不显著（P>0.05）；（2）CB浓度为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL时，各试验组的操作时间差异不显著（P>0.05），但10μg/mL的CB操作速度最快，磨口法三个试验组间去核成功率差异不显著（P>0.05），刺入法在CB浓度为5μg/mL、10μg/mL时去核成功率显著高于20μg/mL组（P<0.05），磨口法去核成功率显著高于刺入法（P<0.05）；（3）去除部分胞质的孤雌胚卵裂率各试验组之间差异不显著（P>0.05），20μg/mLCB处理组囊胚率显著低于其它处理组（P<0.05）；（4）在CB浓度为10μg/mL的操作液中，分别用内径为10μm、15μm和20μm内径的去核针，各试验组间操作时间差异不显著（P>0.05），15μm内径的去核针操作速度较快，磨口法去核成功率差异不显著（P>0.05），15μm去核针去核成功率较高，刺入法应用20μm去核针的去核成功率显著低于其它组（P<0.05）。结果表明，磨口法在10μg/mL CB和15μm内径去核针条件下提高了去核成功率(90.8%)及去核速度（50sec/个），且不影响孤雌胚的体外发育率。     

成熟培养时间对水牛卵母细胞体外成熟的影响

采用ＴＣＭ１９９＋１０％ＯＣＳ为成熟培养液、以Ｔｙｒｏｄｅ｀ｓ改良液为受精液对水牛卵母细胞作体外成熟培养和受精,比较不同成熟培养时间（２４ｈ和３０ｈ）对水牛卵母细胞成熟率和受精率的影响。其结果为,水牛卵母细胞在成熟培养２４ｈ和３０ｈ后,其成熟率分别为６６．５％和６７．２％,受精率分别为５７．５％和４９．０％,在统计学上成熟率及受精率均无显著差异（Ｐ＞０．０５）。表明水牛卵母细胞的成熟培养时间可为２４ｈ和３０ｈ。     

奶牛体外成熟卵母细胞与X分离冻精体外受精及其胚胎发育

比较了X分离冻精和未分离冻精与牛卵母细胞进行体外受精后,受精卵的卵裂率和胚胎发育率。X分离冻精组受精卵的卵裂率（51.4%）和囊胚发育率（19.7%）显著低于未分离冻精组（67.9%,29.9%,P〈0.05）;微量上浮非离心法处理X分离冻精和未分离冻精后,其受精卵的卵裂率（50.7%,65.5%）高于上浮离心法处理组（48.3%,63.8%）,但两种处理方法之间无统计学差异（P〉0.05）;同一种精子采用微量上浮非离心法或上浮离心法处理后,其卵裂胚的桑葚胚发育率和囊胚发育率无统计学差异（P〉0.05）;X分离冻精的受精卵与颗粒细胞和睾丸支持细胞共培养后,其卵裂率（50.0%,51.4%）与非共培养组（50.3%）无显著差异（P〉0.05）;两个共培养组的桑葚胚发育率（53.3%,54.6%）和囊胚发育率（21.1%,21.5%）均高于对照组（52.2%,20.4%）,但无统计学差异（P〉0.05）。