蚕蛹壳几丁质降解菌的分离筛选及其产酶条件优化研究（英文）

[目的]对产几丁质酶菌株发酵产酶活性工艺进行优化。[方法]将筛选得到的一株产几丁质酶菌株G-254进行驯化培养,通过单因素试验考察了不同碳源、氮源和无机盐对菌株产酶活的影响响应面试验利用,以菌株发酵所产酶活为响应值,确定最佳的发酵产酶工艺条件。[结果]菌株G-254发酵产几丁质酶最佳发酵条件为：葡萄糖8%,牛肉膏料5%,硫酸镁0.07%,在此条件下获得的几丁质酶活为6.86U。[结论]该研究提高了菌株发酵产几丁质酶酶活,为后续工业化发酵生产奠定了基础。     

高产乳酸链球菌素生产菌的诱变

为了获得高效价的Nisin生产菌株,采用传统的微生物育种技术,以Nisin生产菌乳酸乳球菌作为出发株,通过紫外照射和亚硝酸处理进行协同诱变育种。根据致死率和诱变剂量的相互关系,分别得出了紫外线照射和亚硝酸诱变的致死率曲线以选择合适的诱变剂量。最终确定采用2.5 min紫外线照射和4 min亚硝酸处理对乳酸乳球菌进行诱变获得突变菌株。突变株经初筛和复筛得到Nisin高产菌株,其发酵液Nisin的效价较出发株高1.72倍。     

土壤中产碱性蛋白酶菌株的筛选及产酶条件的研究

[目的]从土壤中筛选产碱性蛋白酶菌株,并优化产酶条件。[方法]采用平板分离方法从土壤样品中分离出8株产碱性蛋白酶菌株,采用滤纸片法和Folin-酚法测定8个菌株的产酶能力。将具有较强产酶能力的菌株作为目的菌株,研究该菌株产酶能力的影响因素,并采用正交试验法优化产酶条件。[结果]经过初筛和复筛,从土壤中得到一个碱性蛋白酶高产菌株（5号）,作为目的菌株,其产酶能力为6.00 U/ml,为地衣芽孢杆菌的134.1%,该菌株为革兰氏阳性芽孢梭菌。正交试验表明,在pH为11的初始发酵培养基中添加0.3%蔗糖和0.8%蛋白胨,并以105个/ml的接种量接种,目的菌株可得到较好的产酶效果,且蛋白胨对该菌株产酶能力具有显著影响。[结论]该研究为产碱性蛋白酶菌株的筛选提供了理论参考。     

脂肪酶产生菌的筛选·产酶条件及酶特性研究

[目的]筛选脂肪酶高活性菌株作为脂肪酶生产菌株和脂肪酶基因的供体菌。[方法]从油脂厂等地采集26份含菌样品,采用溴甲酚紫平板对样品进行初筛,以产脂肪酶发酵培养基摇瓶复筛,获得1株产脂肪酶活性较高的菌株09-7-1,经鉴定该菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）。采用正交试验对影响该菌株产酶的因素进行了研究,并探讨了该菌株所产脂肪酶的性质。[结果]该菌株最佳产酶条件：碳源为0.5%的可溶性淀粉,氮源为0.2%的酵母膏,培养温度为32℃,发酵液pH为5.2,该菌株最初发酵液中酶活力为13.164 U/ml,优化后酶活力达24.112 U/ml,是最初酶活力的1.83倍。该菌株所产脂肪酶最适作用温度为30℃,最适作用pH为7.0;酶液在60℃保温90 min后,活性损失较少,pH为5.5～10.0内稳定。[结论]该研究可为脂肪酶生产和基因研究奠定基础。     

鳗鲡肠道产蛋白酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

采用酪蛋白平板透明圈法,结合以鱼粉为底物的蛋白酶活力测定法,从欧洲鳗鲡肠道中分离筛选出1株高产蛋白酶的菌株MJ15。通过形态学观察、Biolog鉴定以及16SrRNA基因序列分析,该菌株鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis。对菌株MJ15所产蛋白酶性质进行初步分析,结果显示,其最适作用温度和pH值分别为40℃和5.0,酶的热稳定性以及碱稳定性较差;K~+、Na~+、Cu~(2+)、Fe~(2+)对蛋白酶有激活作用,但Zn~(2+)、Pepstatin A对该酶有抑制作用;该酶的Km值和Vmax值分别为8.77 mg·mL~(-1)和53.48μg·min~(-1)·mL~(-1)。     

绿色木霉H7产纤维素酶条件的研究

采用摇床液体发酵试验,对绿色木霉产纤维素酶活性进行CMC酶活性测定,筛选出一株产纤维素酶活性较高的菌株T075,并通过试验,确定该菌株的最优产酶条件。结果表明,最佳组合条件是液体发酵培养温度30℃,秸秆粉：麸皮为2：1,接种量6%。     

负载Nisin的静电纺OSA淀粉/普鲁兰多糖纤维膜制备及其抑菌性能研究

以辛烯基琥珀酸酐(OSA)改性淀粉和普鲁兰多糖为混合基质,添加乳酸链球菌素(Nisin)作为抑菌剂,通过静电纺丝技术制备负载Nisin的OSA淀粉/普鲁兰多糖纤维膜,并探究不同Nisin浓度(0～20 mg·mL^-1)对纤维膜产率、Nisin负载率、纤维形态及其抑菌效果的影响。结果表明：随着Nisin浓度的增加,纤维膜产率呈降低趋势(26.94%～16.12%), Nisin负载率不断上升(16.59%～21.30%)。Nisin浓度的增加则引起纤维形态的变化,表现为Nisin浓度越大,纤维间粘连程度越高。添加Nisin浓度为20 mg·mL^-1的纤维膜对单增李斯特菌具有最佳的抑菌效果,其次是Nisin浓度为5 mg·mL^-1的纤维膜,其抑菌效果可能受纤维形态和Nisin负载率的共同影响。这一研究为高效制备“绿色”静电纺丝抗菌包装膜提供了参考。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离与鉴定

从泡菜和酸奶中分离出产γ-氨基丁骏(GABA) 乳酸菌10株,筛选得GABA高产菌株B、BY和SS.3个菌株在含10 g·L-1谷氨酸钠(MSG) 的MRS培养基中培养6 d,发酵液中GABA含量分别达到3.680、3.341和2.700 g·L-1.通过16S rDNA基因鉴定和生理生化鉴定,确定菌株B和SS为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis) ;菌株BY为唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius subsp.thermophilus) .     

乳链菌肽抗性菌株的定向筛选及鉴定

利用乳链菌肽抗性菌株中乳链菌肽抗性和乳糖发酵紧密连锁的原因，在含有乳链菌肽、乳糖和溴甲酚紫的选择培养基上，从205个新鲜的牛奶样品中定向筛选乳链菌肽抗性菌株。对筛选到的4株菌分析鉴定结果表明：4株菌均为革兰氏阳性菌，产乳酸，过氧化氢酶试验阴性；通过质粒的抽提和电泳，发现Lactococcus Lactis subsp.lactis ZL2009,ZL2009,ZL2010,ZL2024,ZL2030分别含有1，7，5，3条质粒带，且4株菌的质粒DAN分子大小不完全相同。     

菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化

为提高黑曲霉(Aspergillus niger)A24诱变菌株产菊粉酶的活力,采用单因子试验方法对该菌株的最佳产酶条件进行了优化。结果表明:该菌株在以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4为复合氮源的培养基中,初始pH值6.0,30℃培养72 h的条件下,所得的发酵液中酶活力最高,达到35.21 U/mL,比优化前提高了18%,表明该菌株有一定的应用潜力。     

乳酸乳球菌的质粒消除

质粒消除是鉴定质粒和获得无质粒菌株的重要方法,是乳酸菌进行遗传学改造所需的一项重要技术。试验采用高温和消除剂结合的方法,对乳酸乳球菌镉抗性菌株进行质粒消除,探讨温度、消除剂吖啶橙的用量和作用时间对乳酸乳球菌镉抗性质粒消除的影响。结果表明,39℃高温可以质粒消除,而37和41℃均无此效果;独自吖叮橙作用未获得质粒消除菌株;39℃高温-吖啶橙同时作用比高温-吖啶橙交替作用消除率高,而39℃高温-20μg·mL-1吖啶橙共同作用12d,消除率可达98%。根据消除结果,以疑似功能性质粒为模板,进行PCR扩增,获得预期片段,进一步证实了其功能。     

重组乳酸乳球菌的异常毒性评价

[目的]评价重组乳酸乳球菌的异常毒性,为其制备黏膜免疫活载体疫苗及免疫型微生态制剂提供理论支持。[方法]给小白鼠腹腔注射不同剂量的表达金黄色葡萄球菌纤黏蛋白原凝集素A(ClfA)的重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clf A菌液,评价重组乳酸乳球菌的异常毒性。[结果]注射高、中、低剂量重组乳酸乳球菌液的各组小白鼠7 d内无一死亡,体重增长正常。[结论]重组乳酸乳球菌对机体未见异常毒性,适合制备黏膜免疫基因工程活载体疫苗和免疫型微生态制剂。     

一株乳酸乳球菌对棒曲霉素的去除作用

以筛选得到的可有效去除棒曲霉素的食品生产用菌株乳酸乳球菌MG1363为实验材料,通过改变环境温度、pH对其降解特性进行研究,并通过灭活菌体、提取粗酶液等手段,对乳酸乳球菌MG1363降解棒曲霉素的机理进行初步探究。结果表明,温度、pH对乳酸菌去除棒曲霉素活力的影响显著(P<0.05),去除棒曲霉素的较佳反应环境为30 ℃、pH值5.5~6.0。乳酸乳球菌MG1363既能物理吸附棒曲霉素,也能通过酶解作用降解棒曲霉素,且发挥降解活性的酶为胞内酶。乳酸乳球菌MG1363酶解棒曲霉素为其自身固有的特性,但棒曲霉素可诱导乳酸乳球菌的降解活性。     

乳酸链球菌最适抑菌培养条件的研究

为降低天然防腐剂乳酸链球菌素（Nisin）的生产成本,以金黄色葡萄球菌为试验菌,探讨了直接利用乳酸链球菌（Lactococcus lactis）培养液进行抑菌的最适培养条件。首先通过单因素试验,初步确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比的范围,然后采用正交试验L9（3^3）优化后得到的乳酸链球菌抑茵的最佳发酵条件为：3.0g／100g葡萄糖,4g／100g蛋白胨,2g／100g酵母膏,1g／100g牛肉膏,0.005mol／L MgSO4。优化后的培养基抑菌能力明显提高,此结果可为乳酸链球菌素的生产提供参考。     

乳链菌肽产生菌的筛选及其鉴定

乳链菌肽产生菌中乳链菌肽编码基因、乳链菌肽抗性基因和蔗糖发酵基因紧密连锁.根据该原理,在添加乳链菌肽、蔗糖及溴甲酚紫的M17选择培养基上,从新鲜牛奶样品中定向筛选到6株能在选择培养基上生长的菌株,通过细菌生理生化指标鉴定、16S rDNA序列测定,以及发酵产物的抑菌试验,获得了两株产乳链菌肽的乳酸乳球菌和两株只对乳链菌肽具有抗性但不产生乳链菌肽的乳酸乳球菌.     

乳酸乳球菌抗氧化的研究进展

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)主要是通过发酵产能的,但是有研究发现,在添加氯化高铁血红素后乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)能形成一条呼吸链,在乳酸乳球菌(L.lactis)IL1403中发现了能够编码呼吸链蛋白的基因,同样的现象在粪链球菌中(Strepto coccus feacalis)也有发现。当氧出现在电子传递链中,质子的排出和质子运动势(PMF)的产生都会加倍。相比较其他的兼性或者专性厌氧菌,乳酸乳球菌(L.lactis)的呼吸作用可以促进代谢能量的产生,由于这种呼吸作用,乳酸乳球菌(L.lactis)有更好的生长得率和显著的存活率,这表明在发酵条件下产生的代谢能量不足,从而会限制乳酸乳球菌(L.lactis)的生长。氧在呼吸链中扮演了重要的有益角色,而不是起毒害作用。     

乳酸乳球菌食品级表达载体的改造

[目的]改造乳酸乳球菌食品级表达载体,拓宽原系统的应用范围。[方法]以pNZ8149为基础,在pNZ8149的启动子PnisA下游插入乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白（Usp45）的胞外分泌信号肽基因序列SPusp45,利用特异性引物通过PCR方法删除启动子序列和信号肽基因序列间的酶切位点,确保SD序列和起始密码子间的距离相对最佳,构建分泌表达载体pNZS。将报告基因gus重组到pNZS的多克隆位点中,构建pNZS-gus,电击转化L.lactisNZ3900。以10ng/ml的nisin诱导培养,取培养液进行GUS染色试验。[结果]新构建的L.lactisN3900/pNZS-gus系统可以正确表达有活性的GUS蛋白,并可以将GUS蛋白分泌到细胞外。[结论]该系统的构建成功,为目的蛋白的分泌性表达研究和口服级疫苗的研制奠定了基础。     

乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的工艺优化

[目的]提高乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的水平.[方法]对培养基种类、接种量、培养温度、诱导剂浓度、磷酸甘油二钠浓度等因素进行了优化.[结果]使用DifcoTM M17 Broth培养基培养乳酸乳球菌时,L-苯丙氨酸解氨酶表达活性最高;磷酸甘油二钠对L-苯丙氨酸解氨酶表达活性有较大影响,可提高活性93.8％.通过正交试验,得到PAL最佳表达条件为接种量2.0％,培养温度30℃,磷酸甘油二钠浓度2.0％,诱导剂浓度10.0 μg/L. PAL表达酶活可达3.05 IU/ml.[结论]在发酵扩大培养中优化了L-苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表达条件,为今后生产及应用提供参考.     

乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定

构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。