外源激素对家蚕体内血球数的影响

家蚕幼虫血淋巴所含的血球有5种类型,即原白血球、浆细胞、颗粒细胞、小球细胞和拟绛色细胞.一般认为原白细胞和浆细胞由造血器官直接产生,而其它3种血球是由这两种血细胞通过分裂和分化形成的.     

家蚕血液组分与免疫的关系

<正> 家蚕为一种经济昆虫,在昆虫分类学上属于昆虫纲、鳞翅目、蚕蛾科。由于家蚕幼虫能吐丝结茧,对我国外贸创汇起了积极作用。在农业生产上饲养的家蚕品种为抗病品种,它的免疫力与血液组分有密切关系。 家蚕血液为二种无色或淡黄色透明带粘稠性液体,主要由血浆和6种血球(原白血球、浆细胞、颗粒细胞、小球细胞、拟绛色细     

环境激素阿特拉津对家蚕血细胞的影响

为了探讨环境激素阿特拉津(Atrazine,AT)对家蚕生理的影响,用添加AT的人工饲料饲养家蚕,调查了5龄幼虫血细胞数和血细胞形态的变化,同时调查了血液细胞DNA的损伤情况。结果表明:AT连续添食后,家蚕5龄第4日-6日家蚕血球细胞特征性释放高峰时,0.05mmol/kg低浓度AT区的血球细胞数显著增加(p<0.01),0.10mmol/kg浓度AT区血球细胞数则显著减少(p<0.05),而0.20mmol/kg浓度AT区则没有明显影响;实验浓度的AT添食,家蚕5龄幼虫血球细胞的形态没有发现畸形变化,也未见血球细胞DNA的遗传损伤。结论:家蚕食下能够完成幼虫生长发育的环境激素AT(0.20mmol/kg以下浓度)后,血球细胞形态和细胞核DNA没有受到明显不良影响,但AT会影响家蚕血球细胞数目的变化,可能是家蚕积极应对体外化学物质影响的生理反应。     

利用不同染料复合染色判定家蚕血细胞的存活状况

家蚕有5种血细胞,可以通过吖啶橙(acridine orange,AO)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色来区分。溴化噻唑蓝四氮唑[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,MTT]是一种广泛应用于细胞增殖和活细胞鉴定的染色剂。通过对家蚕血细胞进行复染,即先用MTT染色,再用AO和PI染色,发现以下2种情况:很多颗粒细胞、浆细胞和所有的原血球细胞不能被MTT染色,但AO染色显示为活的细胞;被MTT染色的细胞表面有紫色纤维状物伸出,除了一部分具有伪足的颗粒细胞外,所有被MTT染色的血细胞也被PI染色,细胞核是红色。因此,利用这3种染料对家蚕血细胞复合染色来判断细胞的存活与死亡,需要仔细分析并分别对待。     

家蚕血球的生成机理

家蚕具有开放式的循环系统,各个器官直接沉浸在血液中.幼虫的背中线上有1条背血管,习惯上称之为心脏,背血管通过伸缩运动来提供动力以维持血液循环.家蚕的血液中则存在着很多细胞,即血球细胞.血球细胞在家蚕的代谢、变态以及免疫等方面承担着重要角色,与其生长发育及生理变化有着密切的联系.而血球细胞又是由造血器官产生并释放到血液中的,血液中的血球还可以通过有丝分裂进行增殖.造血器官紧密附着在翅原基的内侧,解剖时很难明确地将两者分开,因此习惯上被统称为翅原基-造血器官复合体,共有4个.本文就家蚕幼虫血球的生成机理作一综述.     

家蚕血细胞系BmHc对脂多糖(LPS)和20-羟蜕皮酮(20E)的敏感性

为研究家蚕的细胞信号转导及外源基因在家蚕血细胞中的表达,用TC-199培养基建立起一个血细胞系BmHc。BmHc细胞系由原血球、小球细胞、颗粒细胞和浆细胞等血细胞组成,细胞倍增时间约30 h。脂多糖(LPS)刺激血细胞合成抗菌蛋白和多肽,启动细胞吸收Ca2+参与细胞的增殖。用Flu-3 AM处理细胞30 min并结合TCS-SP2激光共聚焦扫描显微镜技术对Ca2+的分布、定位进行研究的结果表明,Ca2+主要分布在原血球和颗粒细胞的膜表面,但有部分荧光分布深入到原血细胞核,显示细胞核参与了钙信号的转导途径。同等条件下,用20羟蜕皮酮(20E)处理仅可见轻微的荧光反应。LPS激发并打开了细胞膜上的Ca2+通道,引起细胞内Ca2+浓度的变化。在培养基内加入20E引起的Ca2+浓度变化相对较小,因此,20E不是细胞膜上Ca2+通道的有效激发剂。     

造血器官受损对家蚕血球机能与抗菌活性的影响

为了研究家蚕造血器官受损后的血球机能与抗菌活性 ,对家蚕幼虫的造血器官进行碳离子射线局部照射 ,调查了照射后血球的生死比率及血液的抗菌活性。结果表明 :对照蚕整个 5龄期血液中的死血球数基本不变 ;而照射蚕血液中的死血球数及机能低下的血球数随着发育明显增加 ,熟蚕时与对照蚕达到极显著差异 ;照射蚕血清中的酚氧化酶活性及对大肠杆菌的杀灭效果明显比对照蚕低。由此认为 ,血球的数量减少及其机能低下是引起家蚕免疫机能下降的主要原因。     

家蚕翅原基的一些发育规律研究

为进一步解明家蚕的生长发育机制 ,调查了家蚕 5龄幼虫及蛹期翅原基的大小和形态变化 :翅原基在 5龄前期生长缓慢 ,变态前生长最快 ,2～ 3d及 8～ 11d为形态变化最大的两个时期 ;蛹期翅芽基本不变 ,3d始见初生鳞毛 ,5d时已经呈浓密的毛状 ,8d时翅面鳞毛发育成柳叶状 ,之后逐渐出现分叉 ,9d花纹清晰可见 ,化蛾后翅面鳞片呈现棕榈叶状。进行翅原基摘除和异位移植发现 :4个翅原基全部摘除后家蚕仍能正常生长并发育成蛹和具有交配及产卵能力的蛾 ,表明家蚕血球和造血器官有很强的再生能力 ,家蚕血球细胞的生成可能具有更复杂的机制 ,由此证明了家蚕翅原基异位移植的可行性。     

猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

为构建猪卵巢颗粒细胞的体外培养体系,研究毒素的生殖毒性奠定基础,采用机械分离法从1～5 mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,苔盼蓝染色计算细胞存活率,Giemsa染色和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测促卵泡刺激素受体(FSHR)表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线.结果显示分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度＞97%,细胞结构完整,边缘分明,胞核呈卵圆形位于靠近胞质的中央.另外细胞生长曲线表明,细胞从24 h开始进入对数生长期,并于96 h达到最高密度,之后进入平台期.分离培养的颗粒细胞生长状态良好,且细胞纯度＞97%,是理想的适合进行毒素生殖毒理学的细胞培养体系.     

鸡小黄卵泡颗粒细胞的培养条件优化

为了研究禽类颗粒细胞的功能,建立一套良好的颗粒细胞培养体系至关重要。该研究分离培养了产蛋高峰期母鸡的6～8 mm小黄卵泡颗粒细胞,在细胞基质、不同物种血清、血清浓度上进行优化。结果表明,鼠尾胶原比明胶预铺更能促进颗粒细胞生长,细胞传代至4代才发生死亡。2.5%鸡血清与2.5%FBS(fetal calf serum)、2.5%鸡血清+2.5%FBS相比,2.5%鸡血清传代后细胞形态优于其他组。显微镜观察和EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)检测表明,随着鸡血清浓度的增加,颗粒细胞增殖增加。该研究建立了在预铺鼠尾胶原作为胞外基质,采用含5%鸡血清的培养体系,使得鸡小黄卵泡颗粒细胞传代后仍能保证其增殖特性。     

西藏林芝地区牦牛卵泡颗粒细胞体外分离培养和形态观察

旨在建立牦牛卵泡颗粒细胞模型以研究牦牛生殖生理机制。从林芝市牛屠宰场采集牦牛卵巢,并采用口吸管法在体视显微镜下分离卵巢表面直径为2~5 mm卵泡内的颗粒细胞,用于体外培养。结果表明:原代颗粒细胞培养12~48 h时处于潜伏期,此时细胞刚刚贴壁并且黏附不牢固,增殖分化速度较慢;培养72~96 h时,细胞进入指数增殖期,此时细胞多呈放射状,增殖分化速度最快;培养144 h时形成颗粒细胞单层;然而传代颗粒细胞生长速度较快,48 h后细胞进入指数增殖期,72 h后颗粒细胞生长至培养皿的90%左右,形成颗粒细胞单层。     

猪卵巢颗粒细胞的体外培养

颗粒细胞是猪卵泡的重要组成,其生长及形态功能变化伴随着卵泡的整个发育过程,同时也是研究细胞增殖、分化、信号转导等重要的细胞模型。本试验旨在筛选和摸索原代培养颗粒细胞的理想培养基及培养过程,分别使用DMEM高糖、DMEM/F12、M199、1640完全培养基(86%培养基+12%胎牛血清+1%双抗+1%庆大霉素两性霉素混合液)接种猪卵巢颗粒细胞,置于37℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养,每12 h观察细胞生长状态及形态特征,建立体外培养体系。结果显示,DMEM高糖培养基中,细胞增殖速度快,细胞状态好,细胞形态清晰,培养效果最佳,同时,经FSHR免疫荧光鉴定,分离的细胞为猪卵巢颗粒细胞,且纯度大于98%,说明DMEM高糖培养基在建立体外原代细胞培养体系中效果明显。     

细菌类脂多糖(Lps)对桑蚕血球细胞培养系的蛋白激酶C和A活性的诱导

使用含桑蚕血球细胞(主要是颗粒细胞和浆细胞)的离体培养系,经各种刺激物诱导后,对蛋白激酶C(下称PKC)和蛋白激酶A(PKA,需cAMP型)的活性进行了试验。血球细胞经大肠杆菌中的类脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、离子霉素、霍乱弧菌产生的霍乱毒素或笨基乙酸汞(杀菌剂)(4β—phorbor 12—myristate 13 acetate)(PMA)处理后便可清楚地检测到PKC的活性,而没有上述刺激物诱导时,其活性情况没试验过。结果表明,不仅LPS而且Ca~(2+)和一种G蛋白均可能参与了PKC活性诱导的信号转导。同样用LPS、dcAMP、离子霉素或霍乱毒素处理血球细胞,对PKA的活性进行了类似的检测,而不经处理的对照细胞没有PKA活性,而且LPS、cAMP、Ca~(2+)和G蛋白很可能也参与了PKA活性诱导过程中的信号转导。用抗兔脑PKC—α的单克隆抗体进行蛋白质印迹分析,结果以LPS处理的血球细胞样品中有一种与单抗有交叉反应的90KDa蛋白质,而未经LPS处理的对照样品不存在这种蛋白。桑蚕血球细胞内的PKC和PKA被细菌感染后的LPS激活后,可以诱导自身防御反应,例如抗菌蛋白基因的表达。     

重离子射线照射对家蚕造血器官的生理效应

用碳离子和氦离子射线局部照射家蚕 5龄第 3日幼虫的造血器官 ,调查了对循环血球密度和种类 ,以及其后生长发育和变态的影响。照射后家蚕变态困难 ,结茧率、化蛹率和羽化率显著降低 ;幼虫血液中血球密度在照射后 8～ 2 4h短暂上升 ,随后快速下降 ,5龄后期血球密度显著低下。上述变化程度随射线剂量增加而更加显著 ,而两种离子射线之间没有明显差异。血液中各种血球的比例虽然没有很大变化 ,但照射后出现了一种大型血球。     

牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养

分离培养牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的目的是克服体外受精中早期胚胎发育阻断,建立有利于牦牛早期胚胎体外发育的共培养体系.采集牦牛输卵管上皮细胞进行原代及传代培养,同时从卵泡液中获取颗粒细胞进行原代培养,培养过程中观察2种细胞的生长方式和形态特点.输卵管上皮细胞贴壁生长时,呈多边形,且呈单层成簇生长.培养144 h～216 h,可形成细胞单层.颗粒细胞贴壁生长时,呈现聚集生长特性,贴壁细胞形状不规则,呈放射状.培养72 h～96 h,形成颗粒细胞单层.     

小鼠 鸡卵巢颗粒细胞分离 培养方法的比较与优化

本试验通过分离与培养小鼠、鸡不同等级卵泡颗粒细胞,比较其培养和形态差异,并对提取方法进行优化。试验选取3周龄雌性昆明系小鼠,200日龄的海蓝褐蛋鸡,分别采用优化的方法分离培养卵巢颗粒细胞,通过观察细胞形态、H.E.染色和间接免疫荧光,对比不同种属颗粒细胞提取方法、培养条件及生长状态。结果表明,与采用机械法分离的小鼠卵巢颗粒细胞相比,采用酶消化法分离的鸡不同等级卵泡颗粒细胞贴壁较快、生长速度快、伪足较多。分析得出小鼠与鸡不同等级卵泡颗粒细胞的分离,培养条件均有差异,且对已有提取方法进行优化,所培养的颗粒细胞状态良好。     

禽疫病监测血样采集与血清分离方法

禽疫病监测过程中，确保采集血样能够分离出足够合格的血清，才能保证实验室检测结果的正确。现在基层兽医人员采集鸡血样一般都是先用1次性注射器把血抽出来推进小瓶里待凝固后送实验室分离血清。这样分离血清难度很大，主要是鸡血液粘度较高，有的血样血清虽然悬浮在上层，但是血清凝固成块状与血球凝块粘连在一起很难分离。有的血样血清不沉淀并且与血球凝固在一起，     

添加外源激素FSH对绵羊卵丘颗粒细胞增殖的影响

为了分析外源激素促卵泡激素(FSH)对绵羊卵丘颗粒细胞增殖的影响,试验分离并体外培养了绵羊卵丘颗粒细胞,然后使用促卵泡激素受体(FSHR)免疫组织化学法鉴定了分离培养的细胞,进而分析了添加不同浓度FSH对细胞增殖速度的影响。结果表明:将卵丘颗粒细胞从卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(COCs)上分离24 h之后,能够观察到部分卵丘颗粒细胞开始贴壁,传代之后细胞形态未发生明显变化。FSHR免疫组织化学法鉴定结果证明分离培养的绵羊卵丘颗粒细胞能够特异性地表达FSHR。培养基中添加FSH后,在培养前4 d,高浓度(100 ng/mL)和低浓度(10 ng/mL)的FSH均能促进卵丘颗粒细胞的增殖,但在培养6 d之后,高浓度的FSH对卵丘颗粒细胞的增殖存在抑制作用。说明外源激素FSH在不同浓度下对卵母颗粒细胞的增殖具有不同的影响。     

西藏牦牛颗粒细胞的体外培养

分别收集西藏牦牛卵泡液中和卵母细胞成熟培养后分离下来的颗粒细胞,进行体外培养实验,以优化西藏牦牛颗粒细胞的体外培养方法。实验结果显示:原代培养时,从卵泡液中收集的颗粒细胞和从卵母细胞成熟培养后分离下来的颗粒细胞形成单层分别需要6~7 d和5~6 d;传代培养时,2种来源的颗粒细胞均在接种后第2天开始贴壁,第3~5天呈优势生长,第6天左右长满平皿底,当传至第3代培养后,即可获得纯化的颗粒细胞。实验结果表明,与从卵泡液中分离下来的颗粒细胞相比,收集从卵母细胞成熟培养后分离下来的颗粒细胞进行体外培养具有简便、快速的优点。     

褪黑素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响

采集绵羊卵泡颗粒细胞进行体外培养,根据试验设计加入褪黑素(MLT)和HCG,分别于不同培养时间收集细胞培养液,用放射免疫测定法(RIA)测定细胞培养液中雌二醇(17β-E2)和孕酮(P4)含量。结果表明:卵泡颗粒细胞在无血清培养体系中可体外培养,并能够分泌相应17β-E2;用MLT或MLT与HCG共同处理卵泡颗粒细胞,能促进细胞分泌17β-E2,并呈时间和剂量的依赖性,但对P4的分泌没有影响。