胆固醇氧化酶快速鉴定方法研究

[目的]建立胆固醇氧化酶的快速鉴定方法。[方法]采用初筛和复筛试验,从21种不同来源的样品中筛选出9株高酶活胆固醇氧化酶菌株,采用定性平板检测法、过氧化氢法、羟醛反应法、薄层层析法等定性检测胆固醇氧化酶的活性。[结果]从21种样品中共筛选出48株胆固醇氧化酶菌株,用定性平板检测法从中筛选出9株高酶活菌株（2-6、15-3、3-3、16-5、3-4、4-3、4-6、JM109和10192）,其中4．6酶活最高;过氧化氢法共鉴定出6株高酶活菌株,与定性平板法检测结果一致;薄层层析法可定性检测出胆固醇氧化的唯一产物胆甾4-烯-3-酮。[结论]定性平板检测法和薄层层析法可快速、有效的鉴定出高酶活胆固醇氧化酶菌株。     

高产胆固醇氧化酶菌株的诱变选育

[目的]选育高产胆固醇氧化酶菌株。[方法]从环链拟青霉、斜链拟青霉、中国拟青霉和蛹拟青霉中筛选出发菌株,对筛选出的酶活力高的突变株进行紫外诱变,选育出高产胆固醇氧化酶突变株,对其发酵条件进行优化并测定其酶活。[结果]选择环链拟青霉为诱变选育的出发菌株,紫外诱变环链拟青霉获得了一株高产胆固醇氧化酶突变株CM3,确定了紫外诱变的最佳时间是80S。通过优化其发酵条件,得出CM3发酵产酶最优条件为30℃,pH值6．0,接种量为10％。其最高酶活力为1．3360U／ml,比出发菌株（0．3369U／m1）提高了296．6％。[结论]通过紫外诱变能选育出有较高胆固醇氧化酶活力的菌株。     

1株产胆红素氧化酶新菌株的分离与鉴定研究

[目的]分离与鉴定1株产胆红素氧化酶的新菌株.[方法]利用常规的微生物分离培养技术,从玉米叶片的病斑中分离出一株产胆红索氧化酶（bilirubin oxidase,BOD）的丝状真菌.[结果]通过形态学、生理学和rDNA-ITS（登录号为JN251106）序列分析,该菌株被鉴定为Bipolaris australiensis,命名为B.australiensis HD-1,属子囊菌门格孢腔菌目格孢腔菌科平脐蠕孢属澳大利亚平脐蠕孢霉（B.amtraliensis）,亦称澳洲双孢霉,是1株没有被报道过的具有产BOD的新产生菌;在不合任何诱导剂的发酵液中28℃,150 r/min,培养6d,其酶活可达为1 000 U/L.[结论]该方法成功分离出1株产胆红素氧化酶的新菌株,为BOD的产生菌提供了新的微生物来源.     

两株产胆固醇氧化酶细菌对鸡蛋胆固醇的降解作用

为了对开发低胆固醇的食品提供参考,对从动物粪便样品中分离出的两株胆固醇氧化酶活力较高的假单胞菌和芽孢杆菌,分别对比了其发酵上清液、菌悬液和胞内酶提取液对鸡蛋胆固醇降解的影响.结果表明,两种细菌的发酵上清液具有良好的降解效果,降解率分别达52.1％和49.6％.     

剩余污泥碱性发酵产蛋白酶菌株的筛选与鉴定

为了能够缩短剩余污泥碱性发酵周期,从碱性发酵剩余污泥中筛选产蛋白酶活力较高的耐碱细菌,利用形态学、生理生化、分子生物学特征对筛选到的菌株进行鉴定。结果表明,从碱性厌氧发酵剩余污泥中最终筛选获得2株产蛋白酶活力较高的耐碱细菌HIT-01菌株和HIT-02菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。为进一步利用筛选获得的优势菌株构建生物菌剂、从而快速启动污泥碱性发酵开拓了新思路。     

产涩柿单宁酶菌株的筛选及鉴定

[目的]获得可产生涩柿单宁酶的微生物,并对其鉴定。[方法]微生物在以涩柿为培养基上自然生长,进行划线分离,获得纯种菌株。将菌株接种于溴酚蓝培养基上,选取变色圈较大的8个菌株,进行COD去除率和单宁耐受力试验,选取COD去除率高、单宁耐受力强的菌株,使用形态学观察法进行菌种鉴定。[结果]获得可产生涩柿单宁酶的菌株,初步鉴定为黑曲霉。[结论]利用该方法,可获得产生涩柿单宁酶的黑曲霉,其COD去除率高、单宁耐受力强,有成为工程菌株的潜力。     

青海产菊粉酶菌株的筛选及分子鉴定

从青海省种植菊芋的根际土壤中分离得到能产菊粉酶的菌株46株,从中筛选获得了1株产菊粉酶能力较高的菌株,酶活达到6.67 U·mL-1,且该菌株产菊粉酶类型为外切酶。通过对其rDNA-ITS的序列测定及分析,再结合形态学观察,将菌株鉴定为雅致放射毛霉Actinomucor elegans。     

桑园土壤中高产纤维素酶菌株的筛选与鉴定

为获得高产纤维素酶菌株,以桑园土壤为对象筛选纤维素酶产生菌。以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作唯一碳源,利用刚果红染色法从桑园土壤中筛选得到12株产纤维素酶菌株,其中菌株YZB46产酶效果最好,经酶学性质初步分析,YZB46在pH 6.0、40℃条件下发挥最佳内切葡聚糖酶活性,为17.08 U·mL~(-1),经传代,YZB46的产纤维素酶能力能稳定遗传。通过形态观察、革兰氏染色、生理生化特征及16SrDNA分析,发现菌株YZB46与芽孢杆菌属的Bacillus cereus同源性达99%,并将菌株YZB46鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。     

高产脂肪酶菌株的筛选鉴定

通过变色圈法和透明圈法从泥土中筛选出脂肪酶产生菌,并根据菌株的菌落形态、革兰氏染色和16SrDNA序列分析确定筛选得到菌株的种属。采用罗丹明B(Rhodamine B)平板初筛出51株脂肪酶产生菌,以荧光圈直径或透明圈直径与菌落直径的比值(HC)为指标,选取HC1.60的9株脂肪酶产生菌,采用橄榄油乳化液平板进行复筛,对HC进行测量比较筛选出1株高产脂肪酶的菌株L-17,其HC为2.27。利用透明圈法对菌株L-17的粗酶液的酶活力进行测定,HC为3.07,表明菌株L-17具有较高的酶活力。菌株L-17经初步鉴定为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia),为一株高产脂肪酶的菌株,具有潜在的研究和开发价值。     

多氯联苯污染土壤好氧降解菌群的分离与鉴定

从浙江温岭和萧山长期受多氯联苯污染的土壤中,以联苯为唯一碳源和能源进行菌类的富集筛选共得到35株纯菌,其中革兰氏阴性菌占细菌总数的60%。对得到的35株菌株进行16SrRNA基因序列分析,结果显示温岭和萧山土壤中的优势菌属分别为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)和潘多拉菌属(Pandoraea sp.)。挑选的4株细菌棒状杆菌(Corynebacterium sp.)WL8、芽孢杆菌(Bacillus sp.)WL10、微杆菌属(Microbacterium sp.)XS4和柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)XS7均可在联苯存在情况下共代谢降解2,3,4,5-四氯代多氯联苯(PCB61),其中从温岭土壤中筛选到的Corynebacteriumsp.WL8对PCB61的5d去除率达到了50%。     

珙桐产黄酮内生真菌的分离和鉴定

采用珙桐(Davidia involucrata Baill.)组织分离产活性物质的内生真菌,以金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌为测试细菌进行内生真菌代谢物对细菌的抑制实验,用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析内生真菌的活性物质成分。结果表明,从珙桐枝、叶中分离到126株内生真菌,其产物对3种细菌的抑菌率分别为65%、71%、25%,其中D37菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。经HPLC分析证明,菌株D37的次生代谢产物中含有槲皮素、山奈酚2种黄酮类物质,每100 g干菌丝可产黄酮31.9 mg。根据菌株D37的形态学特征,结合核糖体基因居间序列(Internaltranscribed spacer,ITS)的分析结果,确定菌株D37为曲霉属,烟曲霉种(Aspergillus fumigatus)。从珙桐分离的产黄酮内生真菌D37可作为生产黄酮类药物的候选菌株,也为抗生素药物的筛选奠定了基础。     

苯胺高效降解菌的筛选及其生物学特性研究

采用富集培养法从高阳印染厂排污口土壤中分离得到209株微生物,定向筛选获得2株能够高效降解苯胺的细菌(菌株Ani-4-15和菌株Ani-5-61)。这2株细菌在苯胺浓度为400mg·L-1的培养液中培养30h后,培养液中苯胺的降解率均可达到85%以上;在苯胺浓度为1000mg·L-1的培养液中培养30h后,培养液中苯胺的降解率达70%左右。通过浊度测定法对菌株Ani-4-15和Ani-5-61在苯胺选择性培养基中的生长特性进行了研究,结果表明,两菌株最佳培养时间分别为15h和18h,最适生长温度均为30℃,最适生长pH值分别为7.0和6.0,对苯胺的耐受浓度范围在100～3200mg·L-1之间。在温室条件下,通过在灭菌土中分别接入一定量的苯胺(苯胺含量分别为400、600、800和1000mg·kg-1)和苯胺降解菌(106个菌体·g-1土),48h时菌株Ani-4-15和Ani-5-61对苯胺的降解率分别高达93.4%和96.6%。通过16SrDNA序列分析法明确了两株细菌均为假单胞菌属,利用非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定系统(API20NE)进一步鉴定到种,菌株Ani-4-15为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),菌株Ani-5-61为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。     

萘降解菌的分离与鉴定

[目的]研究降解菌株对萘的降解能力,以期应用于被石油污染的土壤、水源等的生物修复。[方法]以多环芳香烃中含2个苯环结构的萘为材料,从襄樊市郊被石油污染的土壤中富集、筛选和分离能降解萘的微生物,通过生理生化试验,观察菌落及菌体形态。[结果]从土壤样和废油样中分离得到31个能以萘为唯一碳源生长的菌株,其中4个在平板上菌落较大,且具有不同的菌落特征,分别命名为L1、L8、L15和L19。其中,L1菌株对萘的降解能力最好,在初始萘浓度为100 mg/L的无机盐培养基中培养40 h,萘降解率为92%,且培养液中残留萘最少,仅有8 mg/L。菌L1菌株初步鉴定为微杆菌属。[结论]驯化条件是优势菌株筛选的重要制约因素,以萘为唯一碳源可驯化筛选出对萘具有较好降解效果的降解菌。     

硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究

对两种菌肥进行分离硅酸盐细菌,经纯化、鉴定,得到3种硅酸盐菌株。此3种细菌在阿须贝无氮培养基上及无机磷合成培养基上均能正常生长;在牛肉膏蛋白胨培养基上生长微弱;在硅酸盐细菌培养基上生长良好;具有较强的分解硅酸盐的能力,为革兰氏染色阴性(G-)杆菌,过氧化氢酶阳性,葡萄糖发酵产酸阳性,发酵肌醇产酸阳性,经鉴定均为芽孢杆菌属。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的分离和鉴定

【目的】分离筛选能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的细菌,以期能在该毒素的生物解毒处理中得到应用。【方法】用高产毒禾谷镰刀菌F-25接种灭菌的小麦籽粒,培养后获得DON毒素;然后以DON毒素为唯一碳源进行DON毒素降解菌的驯化富集培养,得到能够降解DON毒素的混合菌群,逐一对分离到的细菌进行DON毒素降解能力检测,得到能够降解DON毒素的菌株。【结果】筛选得到的菌株DDS-1对液体培养基中的DON毒素的降解能力达95%以上,显著高于其它菌株;从形态、生理生化特性以及16S rDNA序列进行分析,DDS-1菌株初步鉴定为徳沃斯氏菌Devosia sp.;把DDS-1添加到小麦饲料中后,饲料中的DON毒素降解率达到75.47%。【结论】选出的DON高效降解菌株徳沃斯氏菌,不但对液体培养基中的DON毒素具有很好的降解作用,对饲料中DON毒素也有很好的降解效果。这为真菌毒素的生物脱毒处理提供了可行的方法。     

利用PCR-RFLP方法鉴别黄曲霉毒素产毒菌株

【目的】开发一种精准度高、灵敏性好、简便快捷的鉴别黄曲霉毒素产毒菌株的方法,为粮食储藏中黄曲霉毒素污染提供早期预警,为食品工业的质量安全控制提供技术保障,为黄曲霉毒素污染的生物防治提供无毒微生物来源。【方法】利用生物信息学方法分别以黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasitieus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae）的黄曲霉毒素合成基因簇中的关键调控基因aflR及其启动子序列为研究对象,采用PCR-RFLP方法对黄曲霉毒素可能产生菌株进行鉴别分析研究;为进一步验证PCR-RFLP方法对产毒菌株区分结果,利用大豆培养基对上述菌株进行发酵培养,并利用HPLC方法测定了菌株产毒能力。【结果】生物信息学分析结果表明黄曲霉毒素可能产生菌株的aflR高度同源, 但启动子和结构基因的部分碱基出现了规律性变异,并导致了限制性酶切图谱中的NheⅠ、PvuⅡ和HincⅡ等限制性酶切位点的改变;通过提取各菌株基因组DNA,PCR扩增得到aflR和启动子序列片段,测序得知片段长度分别为798 bp和 515bp;PCR-RFLP鉴定结果表明产生黄曲霉毒素菌株的aflR启动子片段经NheⅠ酶切后得到176 bp和339 bp 2个片段,不产毒菌株无该限制性酶切位点;试验进一步对黄曲霉菌和寄生曲霉菌aflR结构基因的分析发现,利用HincⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR的结构基因,可以分别得到3个片段（387、250和161 bp）和2个片段（548、250 bp）;利用PvuⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR结构基因,可以分别得到2个片段（652、146 bp）和3个片段（413、239和146 bp）;产毒试验表明,米曲霉菌和酱油曲霉菌不产生黄曲霉毒素,PCR-RFLP分析表明不产毒的黄曲霉菌的确丧失了产生黄曲霉毒素的能力;产生黄曲霉毒素各曲霉菌株之间产毒能力差异显著,不但产生的黄曲霉毒素总量高低相差几十倍,其产生的黄曲霉毒素组分也不尽相同。【结论】本研究阐明了在可能产生黄曲霉毒素关键基因aflR序列中存在的差异,通过PCR-RFLP方法快速鉴别黄曲霉菌株产毒与否,并且对黄曲霉和寄生曲霉两种曲霉进行了区分。黄曲霉毒素产生菌株鉴定方法的开发,将为粮油食品安全检测和质量控制,粮食食品生产过程的质量安全控制与监测提供基于分子水平的新型技术。     

两株细菌纤维素产生菌发酵条件优化初探

[目的]对分离获得的二株菌巴氏醋杆菌(ZHC菌)和葡萄糖酸杆菌(TAⅢ菌)的纤维素发酵工艺进行优化研究.[方法]采用单因素实验法和正交试验法,对两株菌进行发酵条件的初步优化,并对优化后的培养基进行产细菌纤维素的验证实验.[结果]单因素碳源实验表明,两株菌都能较好利用的碳源有葡萄糖、甘油、D-果糖、蔗糖,其中以甘油效果最佳;单因素氮源实验表明,两株菌对硫酸铵的利用效果都较差,蛋白胨和酵母膏为最佳复合氮源;验证实验表明:ZHC菌以培养基:甘油3;、蛋白胨1;、酵母膏0.45;、磷酸氢二钠0.2;,30℃,接种量5;,静置发酵10 d时,细菌纤维素产量达4.24 g/L.TAⅢ菌以培养基:甘油4;、蛋白胨1.2;、酵母膏0.45;、磷酸氢二钠0.3;,30℃,接种量5;,静置发酵10 d时,细菌纤维素产量达3g/L.[结论]在利用巴氏醋杆菌(ZHC菌)和葡萄糖酸杆菌(TAⅢ菌),发酵生产细菌纤维素时,甘油是最佳碳源选择,蛋白胨和酵母膏为最佳氮源选择.