转基因抗虫玉米研究及应用

Bt是转基因抗虫玉米育种应用的主要外源基因,包含编码杀虫晶体蛋白(ICPs)的Cry类和Cyt类基因,以及编码营养期杀虫蛋白(Vip)的vip类基因.迄今已有40余种转Bt基因玉米事件被26个国家批准进入商业化种植或饲料食品加工.目前,Bt基因研发仍在进行,并逐步向分离克隆和改造新基因以及构建高效表达载体方向发展.转Bt基因育种工程逐渐扩大靶标昆虫抗性范围,并向复合性状抗虫玉米发展.转化技术亦向高效化和安全化发展.综述了Bt基因作用机理、转Bt基因玉米研发及应用,拟为我国转Bt基因抗虫玉米研发提供参考.     

转Bt毒蛋白基因玉米的研究进展

此文首先回顾了国内外抗虫转基因玉米研究发展历程,归纳总结了转Bt毒蛋白基因玉米的常用转化方法和转基因玉米转化体的鉴定方法,对转Bt毒蛋白基因玉米后续实验的抗虫性分析鉴定及遗传稳定性评价与利用也进行了介绍。进而探讨了Bt毒蛋白基因在玉米遗传转化上善待解决的问题以及未来的发展方向。认为应加大力度对瓶颈技术进行深入研究,以期转Bt毒蛋白基因玉米能够获得更好的发展。     

Bt毒蛋白转基因植物的潜在问题及其研究对策

1 Bt毒蛋白转基因植物研究概述 Bt毒蛋白转基因植物的研究源于1981年Schnepf等人成功克隆Bt杀虫毒蛋白基因.1986年Obukowics等人采用转座子Tn5介导的方法,将cry1Ab基因引入植物的假单孢杆菌,使植物产生抗虫性,创造了第一代Bt转基因抗虫植物     

转Bt基因玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

转Bt基因抗虫玉米为诺华公司含Bt11转化系的杂交种NX4777,能全株表达Cry1Ab杀虫蛋白,以其非转基因受体玉米品种NX4906为对照。在玉米生长至心叶中期(50~60cm高)、抽雄前期和抽丝散粉期分别进行人工接亚洲玉米螟[Ostrinia furnacalis (Guenée)]初孵幼虫40~60头。以食叶级别、存活幼虫数、蛀孔数、隧道长度和雌穗被害级别等,分别作为评价玉米心叶期和穗期的抗性标准。结果表明,Bt玉米食叶级别仅为1级,显著低于对照的7级。Bt玉米平均每株存活幼虫0.04~0.20头、蛀孔0.11~0.15个、隧道长度0.13~0.41cm,雌穗被害级别为0,植株折茎率为0,而对照玉米平均每株存活幼虫6.19~12.41头、蛀孔4.48~7.05个、隧道长度12.41~24.09cm,雌穗被害级别为5.9,植株折茎率高达73.6%~95.5%。室内生测结果亦表明,取食Bt玉米心叶、雄穗的初孵幼虫3d全部死亡,取食花丝7d死亡率达到99%,相比之下取食常规玉米的存活率在88.7%以上。表明表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt对亚洲玉米螟具有很高的抗虫性,能够保护玉米全生育期免受玉米螟的危害。     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

转基因抗虫棉Bt基因与npt II基因的遗传与表达

采用花粉管通道法将含有Bt杀虫基因的pG4AB质粒导入受体棉花中23中,通过卡那霉素筛选,Bt免疫检测条检测,PCR扩增对转基因抗虫棉的各个自交世代进行跟踪研究.结果表明,具有卡那霉素抗性的单株能扩增出Bt基因,而且均有Bt杀虫蛋白表达.Bt基因与npt II基因均整合进了棉花基因组中,相互之间紧密连锁遗传,均稳定表达,因此报告基因npt II可用于研究Bt基因的遗传情况.     

转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因稳定遗传和高效表达及抗虫性研究

通过对转Bt杀虫蛋白基因油菜植株的后代进行卡那霉素抗性分析和PCR技术检测,结果表明:Bt杀虫蛋白基因是以单拷贝、 杂合地整合到转基因植株(T01、 T02、 T03、 T05、 T06、 T07、 T08)的基因组中,并稳定地遗传.ELISA检测表明:在第3～第9叶期Bt杀虫蛋白基因在转基因油菜植株中高效地表达,Bt杀虫蛋白的表达量为170～260 ng/25 m     

棉不同种植年限土壤中Bt基因及其蛋白的残留测定

 从16个多年种植Bt棉花的田块抽取土壤样本。采用PCR和ELISA方法测定了土壤试样中Bt基因序列片段和杀虫蛋白的残留和累积效应。结果表明,以土壤总DNA为模板不能扩增出棉花内标准基因和cry1A基因预期大小片段。连续种植Bt 棉花可以在土壤中低剂量残留Bt杀虫蛋白,但不会导致Bt毒蛋白在土壤中累积。     

转Bt基因棉Bt毒蛋白表达量的时空变化

采用抗体夹心ELISA技术,对转Bt基因抗虫棉植株中Bt毒蛋白含量进行了测定.结果表明,Bt基因在所有检测到的器官中均有表达,但是不同器官中的Bt毒蛋白含量明显不同.在苗期全展功能叶中Bt毒蛋白含量最高,根、茎和叶柄中Bt毒蛋白含量较低;在花铃期当日开花的子房中Bt毒蛋白含量较高,雌雄蕊中Bt毒蛋白较低,花瓣及苞叶Bt毒蛋白含量最低.表明Bt基因在不同器官中的表达强度存在差异.不同生育期的功能叶中Bt毒蛋白含量差异显著,Bt毒蛋白含量在苗期叶片中最高,蕾期次之,花铃期最低.随着棉花生长发育进程的推进,Bt基因在叶片中的表达强度逐渐减弱.Bt基因在棉花体内的表达随着器官的不同、生育时期的不同而表现出时空动态变化.这可能是人们所观察到的转Bt基因抗虫棉对棉铃虫抗性呈时空动态变化的根本原因.     

棉铃虫对Bt毒蛋白(Cry1 Ac)抗性品系的选育

1 997～2000年,用含Bt毒蛋白(Cry1Ac)的人工饲料对来自本所试验棉田的棉铃虫经过室内21代中16代次的筛选,筛选后F19代LC50值(4.3646g@L1)比筛选前F2代LC50值(0.2972 g@L-1)提高了14.7倍.试验还发现雌性棉铃虫对Bt毒蛋白的敏感性大于雄性.对Bt毒蛋白抗性品系筛选前后分别测定了其不同菌系(商品制剂Dipel和Xentari)的剂量-死亡率回归线,发现Bt毒蛋白抗性品系与其不同菌系间不存在明显的交互抗性.     

玉米转Bt基因自交系的抗玉米螟特性鉴定初报

通过田间接卵和室内PCR分子检测,对采用回交法育成的Mo17Bt、478Bt、综3Bt和87-1Bt等4个转Bt基因自交系的抗虫性以及Bt基因的存在,进行鉴定.结果表明,4个转基因自交系群体的抗虫性明显提高,虫孔隧道长度比阴性对照平均缩短49.70%,差异达显著水平,但抗虫性不如阳性对照;群体内,单株间抗虫性仍存在差异,有高抗到高感不同类型,其     

基因枪法转Bt/GNA基因超甜玉米植株的获得及抗虫性鉴定

以超甜玉米自交系S1幼胚诱导的愈伤组织为受体材料,利用基因枪法共转化Bt和GNA基因,获得了128株再生植株,移栽成活31株,其中26株可育.经PCR检测外源基因整合进玉米基因组中,含Bt基因11株,其中有5株能扩增出GNA基因.Southern杂交证明,目的基因已经整合在玉米基因组中.对9株转基因T1代植株叶片室内接虫抗性鉴定,结果显示,5株转基因植株叶片饲喂6 d后明显抑制玉米螟幼虫的发育,幼虫体重增加较少,幼虫死亡率高,表现较强的抗性.     

Concentration of moniliformin produced by Fusarium species in grains of transgenic Bt maize hybrids compared to their isogenic counterparts and commercial varieties under European corn borer pressure

The European corn borer (ECB), Ostrinia nubilalis Hb., is a major pest of maize in Central Europe and is suspected to promote infection of maize with Fusarium species. The objectives of this study were to (1) determine moniliformin (MON) concentration in early maturing European Bt maize hybrids, their isogenic counterparts, commercial cultivars and experimental hybrids, (2) evaluate the association between MON concentration and ECB resistance and (3) correlate MON concentration with concentrations of other mycotoxins determined from the same plant materials. The field experiments were performed at five locations in Germany. MON concentration was significantly higher with manual infestation of ECB larvae (296 μg/kg) than under insecticide protection (66 μg/kg). Bt hybrids showed significantly lower MON concentrations and higher grain yields under manual ECB infestation than their corresponding isogenic counterparts, as well as commercial and experimental hybrids. All ECB resistance traits and grain yield under ECB infestation were significantly correlated with MON concentration. Correlations between concentrations of MON and other Fusarium mycotoxins were not significant. The use of Bt maize hybrids or insecticides to control ECB reduces the contamination of maize grains with MON in Central Europe. The presence of resistance genes against Fusarium species in the current elite maize germplasm was indicated by ECB susceptible non‐Bt hybrids with low‐MON concentrations.     

农杆菌介导的梭梭BADH基因转化玉米的研究

探究影响玉米遗传转化效率的因素,对玉米遗传转化系统的建立与完善有重要意义。以‘宁玉0905’为材料,经农杆菌介导将梭梭的BADH基因转入玉米基因组。结果表明：在黑暗条件下,加入乙酰丁香酮(AS),玉米遗传转化效率提高;当菌液浓度OD₆₀₀=0.3,浸染时间为5 min时,玉米的转化效率最高;农杆菌和愈伤组织共培养2天,玉米的遗传转化效果最好。对转化苗进行PCR检测得出BADH基因已整合到玉米基因组中。当菌液的OD₆₀₀=0.3,浸染时间为5 min,农杆菌和愈伤组织共培养2天时,玉米的转化效率最高。     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

利用 F2 转 Bt 基因抗虫杂交棉新策略

通过不同抗虫棉品系间互交、后代选择的方法选育出聚合整合位点不同的Bt基因纯合抗虫棉种质,开展了培育以 F2 利用为目的的杂交种探索研究.类似 F2 世代 Bt 基因的不同分离类型,聚合有不同数目 Bt 基因的棉株在整个生育期对棉铃虫有显著的抗虫性.并且与单价抗虫棉时空表达一致,生育前期抗虫性好,毒蛋白表达量高,中、后期抗虫性有所下降,毒蛋白表达量降低.因此,用其作为亲本配置抗虫杂交种,是利用棉花F2 杂种优势的途径之一.