禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因N端区的克隆与表达

为探讨禽鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的生物学功能,本实验根据禽类鹦鹉热嗜性衣原体Cal-10株全基因序列设计引物,用PCR法扩增禽嗜性衣原体PmpD基因N端区,将特异性目的基因片段克隆入PBS-TII载体,经测序后确认为目的基因,并提交GenBank。试验扩增的禽鹦鹉热嗜性衣原体Cal株PmpD基因与禽鹦鹉热衣原体6BC株的PmpD基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与流产衣原体成员嗜流产衣原体S26/3株、嗜豚鼠衣原体(GPIC)、嗜猫衣原体(Fe/C-56)核苷酸相似性分别为89%、82%和77%。PmpD基因N端区基因亚克隆到pET-32a(+)载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果表达了约63 ku大小的融合蛋白;分别用禽鹦鹉热嗜性衣原体多克隆抗体、猪、羊流产嗜性衣原体多克隆抗体与表达出的重组蛋白进行Western blotting检测,结果表明该蛋白与禽源衣原体多克隆抗体呈阳性反应,与猪、羊源衣原体多克隆抗体呈阴性反应,显示该重组蛋白具有种属特异性。本研究首次表达了禽类鹦鹉热嗜性衣原体PmpD基因的N端区的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能提供依据。     

V型小麦细胞质雄性不育“三系”及杂交种线粒体DNA的比较研究

以V型小麦细胞质雄性不育系及相应的保持系、恢复系以及其杂种F1为材料,用ISSR、SRAP、RAPD分子标记技术对它们的线粒体DNA进行了比较分析。结果如下:(1)153个SRAP引物组合中139个组合扩增出了多态性,9个组合扩增出不育系特有而保持系、恢复系、F1均缺失的片段,3个组合扩增出不育系特异缺失的片段。(2)92个ISSR引物中45个扩增出了多态性,筛选到了6个不育系特有而保持系、恢复系及杂种F1均缺失的片段。(3)288个RAPD引物中281个扩增出了多态性,4个引物扩增出不育系特有的片段,3个引物扩增出不育系特异缺失的片段。在对线粒体DNA进行分析时,SRAP比ISSR多态性好,比RAPD稳定性好。     

16份黄秋葵种质的ISSR分析

对Owayadei（Abelmoschus esculentus L.）、Ladies finger（Abelmoschus esculentus L.）、golder kost（Abelmoschus esculentus L）、Esoyarido（Abelmoschus esculentus L.）等16份国外黄秋葵栽培种质进行ISSR分析,结果表明,选用14条引物扩增出162个DNA片段,平均每个引物可扩增出11.6条片段,其中多态性片段102个,占扩增总片段的62.96%。利用扩增结果进行遗传距离分析,构建了分子树状图,可以把16份材料划分为4个类群。     

鹦鹉热衣原体real-time quantitative PCR检测方法的研究

[目的]为鹦鹉热衣原体的快速、准确检测奠定基础。[方法]根据鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因序列设计一对特异性引物,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,建立了鹦鹉热衣原体Real-time quantitative PCR检测方法。根据检测结果,计算样品的批内和批间变异系数(CV)。[结果]以提取的鹦鹉热衣原体DNA为模板,用引物Cps-1和Cps-2进行PCR扩增,得到长100 bp的片段。扩增产物回收纯化后,连接到pGEM-T Easy载体上并转化到大肠杆菌DH5α,菌落PCR检测筛选阳性克隆,培养后提取质粒DNA。当模板浓度范围为1.78×102~1.78×108拷贝/μl时,标准曲线相关系数达0.998;批内和批间变异系数(CV%)分别为1.30%~4.59%和5.72%~9.87%。[结论]为鹦鹉热衣原体的感染、流行调查等提供了重要的技术参考。     

鹌鹑性别鉴定的分子标记方法

采用PCR方法扩增北京白羽蛋用鹌鹑基因组中性别基因CHD相关片段,探讨鹌鹑性别的分子标记方法。通过特异引物2550F/2718R,对3对已知性别和14只未知性别鹌鹑性别基因片段进行特异性扩增。结果表明,这对引物从雄性鹌鹑中扩增出1条片段,从雌性鹌鹑中扩增出2条片段,可以对鹌鹑的性别作出准确鉴定。该方法可以应用于初生鹌鹑的性别筛选,降低饲养成本,提高经济效益。对2条片段进行克隆测序,片段长度分别为613和446bp。     

白枕鹤性别的分子鉴定方法

根据鸟类性染色体连锁基因EE0.6在Z、W染色体上PCR扩增产物长度的不同,利用4个引物组合对白枕鹤EE0.6基因上的相关片段进行特异性扩增.结果表明:这4个引物组合能从雄鹤中扩增出1条片段,从雌鹤中扩增出2条片段,从而成功地对白枕鹤的性别作出准确判断,有利于白枕鹤的成功配对和繁殖.     

金针菇子实体颜色基因的分子标记

用群体分离分析法从200个随机引物中筛选出S375,其扩增片段与金针菇子实体白色基因连锁.对S375扩增片段两端测序,以该序列为依据合成一对特征序列扩增区域(SCAR)引物,它能对带有白色基因的菌株扩增出单一片段,多聚酶链反应(PCR)产物不需电泳、加EB后可在紫外灯下直接检测.     

应用巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别

为获得一种高效的牛胚胎性别鉴定方法,采用高特异性和灵敏度的巢式PCR进行扩增。结果表明:公牛可以扩增出187bp的SRY基因片段和255bp的β-珠蛋白基因片段,母牛只能扩增出255bp的β-珠蛋白基因片段。巢式PCR只需3～8个细胞就可以观察到扩增结果,而常规PCR则需要较多的细胞,所以牛胚胎性别鉴定时使用巢式PCR效果更好。     

花椰菜叶色突变的RAPD分析

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)分析方法,对花椰菜灰绿色叶片正常植株及其绿色叶片突变体的基因组DNA进行差异分析,使用122个10bp随机引物进行RAPD反应,扩增片段分子量在0.3～2.5kb之间,其中S140在植株间扩增出差异片段1条。结果表明,花椰菜不同叶色基因组DNA之间存在明显差异,扩增出的差异片段对进一步研究花椰菜叶色基因调控具有重要的价值。     

猪圆环病毒2型体外滚环复制方法的建立

通过建立猪圆环病毒2型(PCV-2)体外滚环复制(RCA)方法,为PCV-2体外检测探寻更为简便易行的路径。先将西北农林科技大学预防实验室保存分离纯化的PCV-2病料以传统PCR方法扩增出全基因组片段,然后在没有PCR扩增仪的情况下,只用简单的恒温装置,摸索RCA扩增条件,建立体外扩增PCV-2全基因组的方法。最后将2种方法扩增的全基因组片段进行测序,对其相似性进行比对。结果表明,以传统的PCR方法和RCA方法均扩增出1 767bp大小的片段,测序发现两者相似度达到99.9%。可见,成功建立了PCV-2体外滚环复制方法,扩增出病毒的全基因组片段。     

猪流产衣原体CP/12株omp-1基因的克隆与表达

为观察重组MOMP蛋白的免疫活性，揭示omp-1基因(编码MOMP蛋白)在猪流产衣原体诊断和防治中的作用，用PCR法扩增猪流产衣原体omp-1基因，将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体，测序比较分析序列后确认为目的基因，与GenBank中4株流产衣原体omp-1基因和氮基酸序列的相似性均达99％，与其他各型衣原体代表株的相似性为71％～88％，氨基酸序列也有较大差异。将omp-1基因亚克隆到pET-32a表达载体上，再对重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌，以IPTG诱导该重组菌，结果显示该重组菌表达了融合蛋白；用猪流产衣原体多克隆抗体对表达的重组MOMP蛋白进行Western blot试验，结果显示该重组MOMP蛋白具有结合特异性抗体的活性。     

流产嗜性衣原体1B株pomp18基因β折叠区的克隆与表达

为探索POMP18蛋白的生物学功能、揭示其在流产衣原体病诊断和防治中的作用,本试验依据流产嗜性衣原体S26/3株全基因序列设计引物,用PCR法扩增流产衣原体pomp18基因β折叠区,将特异性扩增片段克隆入pMD18-T载体,测序比较分析序列后确认为目的基因,提交GenBank(Accession EU326104).与GenBank中流产嗜性农原体S26/3株的pomp18基因和氨基酸序列的相似性均达99%,与其他各型衣原体代表株的相似性为79%～80%.将pomp18基因β折叠区亚克隆到pET-32a(+)表达载体上,重组表达载体转化BL21(DE3)表达宿主菌,以IPTG诱导该重组菌,结果显示该重组菌表达了59 kD大小的融合蛋白;用羊流产嗜性衣原体多克隆抗体对表达的重组蛋白进行Western blotting试验,结果显示该重组蛋白具有免疫原性.本研究首次克隆、表达了流产衣原体pomp18基因β折叠区,原核表达获得了59 kD重组蛋白,为进一步探讨其生物学功能奠定基础.     

马流产沙门氏菌的分离鉴定及其微量凝集抗体检测方法的建立与应用

【目的】 对流产马驹组织进行马流产沙门氏菌的分离和鉴定,以分离株制备凝集抗原,旨在建立一种敏感、特异、操作简便和高通量的微量凝集方法,实现对马流产沙门氏菌抗体进行快速检测。【方法】 利用沙门氏菌显色培养基对流产的马驹脏器进行细菌分离,对紫色菌落进行革兰氏染色鉴定;提取细菌全基因组,利用16S rRNA 进行 PCR扩增和测序鉴定,并对菌株进行生化鉴定和血清型鉴定,对病因进行综合诊断。利用分离获得的阳性菌株进行灭活后作为凝集抗原,以马流产沙门氏菌标准阳性血清作为阳性对照,通过反应条件优化,建立微量凝集试验方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了验证。与国家行业标准中的试管凝集试验方法进行对比,同时利用微量凝集对华北和西北各3个地方的共151份血清样品进行检测,并随机选取30份样品,利用微量凝集和试管凝集进行检测,并对两种方法检测的敏感性进行比较分析。【结果】 各流产马驹组织在沙门氏菌显色培养基上划线结果,均可以获得大量紫色目标菌落;革兰氏染色结果表明,分离的菌株为革兰氏阴性短杆菌,16S rRNA测序证实分离株为沙门氏菌属,生化鉴定结果表明,分离的17株菌均符合马流产沙门氏菌的生化特性,但相比上世纪强毒株马流产沙门氏菌C77-1,均不能发酵鼠李糖;血清型鉴定证实分离株均为马流产沙门氏菌,将分离的17株马流产沙门氏菌分别命名为E.S-1—17。因此证实马匹流产均为马流产沙门氏菌感染所致。利用甲醛对E.S-1菌株进行了灭活处理,成功制备了马流产沙门氏菌凝集抗原,并建立了一种快速敏感的微量凝集检测方法,其中优化了最佳反应凝集抗原浓度为4亿/mL。其敏感性比试管凝集高1个滴度,其特异性与其他常见马传染病病原阳性血清无交叉反应,并且具有良好的重复性。利用微量凝集方法,对华北3个疫情区进行检测,阳性率分别为28.6%、42.9%和27.3%,西北3个无疫情区阳性率均为0%。此外,利用两种方法对相同的30份临床血清进行检测,微量凝集和试管凝集方法阳性份数分别为10份和3份,阳性率分别为33.3%和10%。与试管凝集相比,微量凝集诊断敏感性为100%,诊断特异性为74.1%,总体符合率为76.7%。【结论】 分离鉴定获得了17株马流产沙门氏菌,建立了马流产沙门氏菌微量凝集抗体检测方法,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,简便、快速、高通量,可以广泛应用于马属动物中马流产沙门氏菌抗体的检测,是该病诊断及疫苗评估的重要依据之一。     

抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)单克隆抗体的制备及初步应用

制备抗沙眼衣原体(CT)单克隆抗体,建立沙眼衣原体的胶体金免疫层析快速检测方法。采用纯化沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)免疫Balb/c小鼠,选取高效价的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,ELISA检测筛选分泌抗MOMP单克隆抗体(McAb)的细胞株并进行相关鉴定。共获得分泌IgG1,IgG2b和IgM的3株单克隆抗体杂交瘤细胞株。纯化的单克隆抗体与鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎支原体均无交叉反应。通过位点分析选择配对良好的两株McAb,制备检测CT的双抗体夹心法免疫层析试纸条。制备的胶体金试纸条对MOMP的最低检出值可达50 ng·mL-1。     

犬巴贝西虫病PCR检测方法的建立

为快速、准确检测犬巴贝西虫病,根据GenBank中收录的犬的巴贝西虫18sRNA基因序列,设计合成1对特异性诊断引物,建立了PCR诊断方法。结果扩增出了犬巴贝西虫18sRNA基因的一段大小为319bp片段,经测序,所扩增序列与报道的序列完全匹配。同时对附红细胞体、巴氏杆菌DNA样品进行扩增没有出现扩增条带。阳性犬全血DNA稀释1 000倍后,依然可以有效地检测出虫体DNA。结果表明,所建立的PCR检测方法,具有极高的敏感性和特异性,可以运用于临床检测巴贝西虫病。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)病的方法,根据GenBank中登录的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计1对特异引物,优化反应体系后,建立了IBRV PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法可从IBRV DQ株中扩增出398 bp的特异性片段,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK细胞的扩增结果均为阴性。该方法检测IBRV的敏感性可达10-3 TCID50·mL-1。应用建立的PCR方法能够从发病的临床样品中检测出IBRV且比病毒分离方法更为敏感,操作简便。结果表明建立的PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于IBRV的临床检测。     

多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。     

转基因棉籽DNA提取纯化及快速PCR检测研究

以棉籽为原料,探索一种快速、简便的棉籽DNA的提取纯化方法以及PCR检测该棉籽是否为转基因的方法。该方法能从200mg棉籽中提取0.4μg高纯度DNA,用于PCR检测。针对18S rDNA、CaMV35S、NOS、NPTⅡ和CryⅠA(c)等基因进行了棉籽中内外源基因PCR检测,分别扩增出不同的目的片段,为颗粒类产品的外源基因检测提供了可行方法。     

驽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及应用

根据驽巴贝斯虫BC-48基因序列,设计并合成1对特异性引物,建立了驽巴贝斯虫PCR检测方法。试验扩增出610 bp的基因片段,其序列与GenBank上驽巴贝斯虫BC-48基因同源性为96.7%。而对新孢子虫、弓形虫、马巴贝斯虫的基因组DNA没有扩增带出现。对驽巴贝斯虫基因组DNA的最小检测量为2.812 fg/μL。通过对35份临床样品的检测,阳性率为20%。同时与血液涂片染色镜检进行了比较,结果表明,PCR检测方法准确、敏感、特异。