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为了获得具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能力的绵羊胎儿成纤维细胞,采用组织块和酶消化法分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体转染法将shRNA转基因表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经抗性筛选获得抗性细胞克隆,利用PCR方法对获得的细胞克隆进行鉴定,用BVDV侵染转基因细胞,利用real-time PCR和病毒滴定测定法分析不同细胞克隆抑制BVDV复制的能力。结果显示:试验成功构建了靶向BVDV表达shRNA的转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-sh BVDV,经抗性筛选共获得22个抗性细胞克隆;22个细胞克隆中12个细胞克隆含有目的基因,为转基因细胞,其中5个转基因细胞克隆具有明显的抗BVDV复制的能力,最高抗病毒效率达到90.7%。结论:在细胞水平能有效抑制BVDV病毒增殖的转基因绵羊胚胎成纤维细胞的获得,为进一步利用体细胞核移植技术制备转基因绵羊提供了合适的供体细胞。 相似文献
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试验旨在建立绵羊羊水来源多潜能干细胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFSC)外源基因高效转染及快速筛选方法,同时保持其多潜能特性。采用脂质体法,以pCMV-DsRed为报告质粒,转染绵羊AFSC,36 h后,流式细胞仪分析外源基因的瞬时转染效率为69.17%。以浓度为6 mg/mL的G418筛选5 h获得纯化转基因绵羊AFSC单克隆。转基因绵羊AFSC RT-PCR检测表达Oct-4、SSEA-1,体外悬浮培养可形成类胚体。结果表明,转基因标记绵羊AFSC保持了发育全能性的潜能,构建的转基因绵羊AFSC可以示踪性研究其在体内的分化路径和最终宿主。 相似文献
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对于生物领域来说,转基因克隆动物的出现,可谓是掀起了一股新的研究热潮,不仅体现了极高的科学意义,而且还存在着极强的应用价值。转基因克隆动物最引人注目的时期是在1997年的英国,克隆绵羊“多莉”的出世,使转基因克隆动物的研究在全球生物领域风起云涌。那么到底当前转基因克隆动物的研究现状如何呢?笔者在本文中简单介绍了转基因克隆动物的含义、方法与应用发展领域,并总结了一系列亟需我们不断探索与完善的问题。 相似文献
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转基因动物研究始于上世纪70年代,至今已在牛、羊、猪、鱼、猴、兔、狗和猫等动物身上取得转基因成功.根据目前的生命科学和生物技术的发展现状和趋势,动物转基因技术和动物克隆技术的有机结合既有迫切性又有必然性.转基因克隆动物技术在畜牧业上的应用前景也相当诱人,转基因克隆动物的研究将成为今后国际范围内生物工程领域的竞争热点.文中综述了国内外利用转基因技术培育绵羊和山羊新品种,进行羊乳腺生物反应器和生产生物材料的研究以及我国目前正在进行的转基因羊项目,在论述转基因动物发展有利方面的同时,指出了转基因羊存在的问题和今后的研究方向及发展前景. 相似文献
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《中国兽医学报》2014,(12):1982-1988
为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。 相似文献
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首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。 相似文献
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体细胞克隆绵羊“多莉”(Dolly)的诞生,表明成年哺乳动物体细胞具有基因组的全能性。本文从“多莉”诞生的背景、体细胞克隆技术的研究现状、体细胞核移植过程中的核质互作、该技术目前存在的问题及其在制作转基因动物上的应用等方面,概述了体细胞克隆技术的研究进展。 相似文献
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动物体细胞克隆技术的研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
体细胞克隆绵羊“多莉”(Dolly)的诞生,表明成年哺乳动物体细胞具有基因组的全能性。本文从“多莉”诞生的背景、体细胞克隆技术的研究现状、体细胞核移植过程中的核质互作、该技术目前存在的问题及其在制作转基因动物上的应用等方面,概述了体细胞克隆技术的研究进展。 相似文献