百脉根泛素结合酶LjE2的表达及活性鉴定

为了研究泛素化作用在豆科植物共生固氮过程中的调控功能和作用机制,利用拟南芥泛素结合酶E2的序列,在百脉根基因组上鉴定得到14个编码E2(LjE2)的基因,从LjE2中克隆到11个基因并构建了融合表达载体pET-LjE2s:His。通过大肠杆菌表达系统,表达并纯化到10个LjE2:His融合蛋白。经体外泛素化及Western blot分析,在10个LjE2中有9个具有泛素结合酶活性,1个(LjE2-5)未检测到泛素结合酶活性。     

栗疫病菌泛素核糖体L40融合蛋白基因的克隆与分析

用酿酒酵母(Saccharyomyces cerevisae)泛素融合蛋白基因从COGEME(Consortium for the functional genomics of microbial eukaryotes)植物病原菌EST(Expressed sequence tag)库中BLAST(Basic local alignment search tool)得到栗疫病菌的泛素融合蛋白EST,设计引物从栗疫病菌cDNA中克隆到该基因并测序,得到在进化上高度保守的基因,该基因开放阅读框为387 bp,编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;由cDNA序列推定的氨基酸序列分析结果表明,泛素融合蛋白前体包括氮末端的泛素结构域(76个氨基酸残基)和碳末端的核糖体蛋白L40结构域(52个氨基酸残基).该蛋白为高碱性蛋白,碳末端含有一个"锌指"模式结构.与19个物种比较的结果表明,栗疫病菌与真菌泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性.     

牡丹泛素延伸蛋白基因片段克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从牡丹(Paeonia suffruticosa)花瓣中克隆得到泛素延伸蛋白基因的cDNA片段,该片段长423bp,编码140个氨基酸残基,命名为PsUBQ,GenBank登录号为JN699053。PsUBQ编码的蛋白是在泛素单体后融合了1个核糖体S27a多肽,经多重序列比对发现该蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜樱桃(Prunus avium)、葡萄(Vitis vinifera)等高等植物泛素延伸蛋白的氨基酸序列具有很高的一致性。实时荧光定量PCR分析表明:PsUBQ在牡丹不同组织间表达较稳定,且在切花开放各级别花瓣中呈组成型表达。PsUBQ的克隆与表达为进一步探讨牡丹开放衰老进程中泛素对激素信号的作用机制打下基础,同时为研究牡丹目标基因的表达提供校正标准。     

拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测

在拟南芥中,Rad23基因通过参与泛素/26S蛋白酶体途径调节植物生长发育和激素应答.为进一步研究该基因编码蛋白的分子作用机制及其生物学功能,构建了pCold-Rad23融合蛋白重组表达载体,将该载体转化到大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明,分子质量为94 ku左右的融合重组蛋白在大肠杆菌中获得高效表达.采用纯化的重组蛋白多次免疫昆明小白鼠的方法,获得了特异性强并且效价高的多克隆抗体,经蛋白印迹检测,在分子质量40 ku左右处出现特异的蛋白质条带,证明所制备的抗血清可以与拟南芥Rad23蛋白特异性结合.     

家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构; Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L^-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。     

SCF泛素连接酶的体外泛素化体系构建与检测

为研究蛋白质的体外泛素化过程,利用大肠杆菌表达系统异源表达和纯化APPBP1/UBA3 （E1）、UBC12 （E2）、Cullin1-Rbx1 （E3）和Nedd8 （neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 8）蛋白,制备FITC-Cysteine 绿色荧光素标记的泛素Ub（Ubiquitin）,构建了SCF泛素连接酶的体外泛素化体系,同时实现快速检测SCF泛素连接酶中Cullin1蛋白的自泛素化修饰。结果表明,建立的体外SCF E3自泛素化活性反应体系具有较高的可操作性和便利性。     

玉米泛素结合酶基因家族的生物信息学及表达分析

[目的]利用生物信息学分析玉米泛素结合酶(E2)基因家族的理化性质和功能,并研究低磷处理下泛素E2基因在玉米幼苗不同组织部位的表达情况,为深入研究泛素E2基因响应低磷胁迫的分子机制提供理论参考.[方法]以MEGA 6.0邻接法(NJ)构建拟南芥、水稻和玉米E2基因家族成员的系统发育进化树,利用生物信息学方法对75个玉米E2基因进行序列分析及理化性质预测.对玉米幼苗进行低磷处理,分别在0、1、6和24 h时采集其根部和叶片样品,并分别通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其E2亚家族XVIII成员基因即ZmUBC17、ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58在玉米幼苗不同组织中的表达情况.[结果]拟南芥、水稻和玉米的E2基因可划分为18个亚家族,各亚家族间基因功能和进化关系较相近,但含有的E2基因数量差异明显,以亚家族VI的成员最多,亚家族X、XII和XV的成员数最少,均为3个,各亚家族中均分别含拟南芥、水稻和玉米E2基因各1个.玉米E2基因的编码区序列(CDS)长度为402~2616 bp,编码133~871个氨基酸,外显子数目数量存在明显差异,以4~6个居多,最少为1个,最多为12个.86.8%的玉米E2蛋白为不稳定蛋白.玉米E2亚家族XVIII成员中,ZmUBC18、ZmUBC48、ZmUBC57和ZmUBC58蛋白UBC结构域序列具有高度相似性,但与ZmUBC17存在明显差异,且这4个基因在玉米根和叶中均有表达,基因表达模式相似,整体上在低磷处理6 h时的表达量最高;低磷处理下ZmUBC17基因在根中不同时间点的表达量变幅较小,但在叶0~24 h时的表达量呈逐渐升高的变化趋势,尤其是24 h时表达量达最高,表明ZmUBC17基因的响应部位是叶片.[结论]玉米泛素E2蛋白可能参与调控对磷元素的吸收,尤其是ZmUBC17基因具有组织表达特异性,在叶片中大量表达,推测ZmUBC17基因通过调控玉米对磷元素吸收和转运间接影响光合作用效率.     

绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger基因的克隆表达及序列分析

【目的】对绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger蛋白的基因进行克隆,表达以及序列分析,初步探究绵羊痘病毒RING finger蛋白是否具有E3泛素连接酶活性,为阐明其在绵羊痘病毒感染过程中对泛素蛋白酶体系统的调控作用奠定基础.【方法】以绵羊痘病毒甘肃古浪株DNA为模板,通过PCR扩增RING finger基因.利用Pfam数据库、DNAstar等软件进行序列及遗传进化分析;将RING finger基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-SPPVRFP重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行SDS-PAGA和Western-blot分析.【结果】绵羊痘病毒RING finger基因由723个核苷酸组成,编码的240个氨基酸的分子量约为28.5 ku,具有RING finger结构域.不同羊痘病毒株间RING finger基因核苷酸序列同源性高达99.2%,氨基酸序列同源性高达98.3%.不同的RING finger蛋白都含有8个保守的半胱氨酸和组氨酸.SDS-PAGA分析显示,重组SPPVRFP大小约为55 ku,Western-blot分析显示,重组SPPVRFP不能与绵羊痘病毒阳性血清反应.【结论】成功克隆、表达并纯化了绵羊痘病毒RING finger基因,对SPPV GS-GL株RING-finger蛋白进行序列分析,推测其可能具有E3泛素连接酶活性.     

鸡马立克氏病毒UL36~(USP)的pTYB1表达载体的构建及表达分析

UL36USP是马立克氏病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段(UL36USP),为获取无冗余氨基酸残基的纯净UL36USP蛋白。试验采用p TYB1表达载体与目的基因UL36USP构建重组表达质粒,并诱导融合蛋白表达,在含有还原剂DTT的缓冲液中利用Intein发挥内含肽的剪切活性,将UL36USP从融合蛋白上分离出来,实现目的蛋白UL36USP的单柱纯化,纯化后的蛋白不带有冗余的氨基酸残基,并利用UL36和Intein的特异性抗体进行了Western Blot鉴定。该研究尝试了一种能有利于难表达蛋白的可溶性表达的方法,并利用Intein标签的剪切活性分离产生纯净的目的蛋白,如一些难表达的病毒蛋白,为抗病毒和抗肿瘤疫苗的研究提供材料。     

泛素/26S蛋白酶体途径调节作物种子大小的研究进展

泛素/26S蛋白酶体系统（ubiquitin/26S proteasome system, UPS）是蛋白质泛素化的重要途径,作为蛋白质翻译后重要的修饰系统,在作物生长发育的各个阶段发挥重要作用。大量研究表明,UPS中泛素受体蛋白、E3泛素连接酶、去泛素化酶等能相互协调,通过在目标蛋白上连接或去除不同数量的泛素来介导目标蛋白的降解、改变亚细胞定位、蛋白活性等,从而调控种子的大小。对不同作物中泛素/26S蛋白酶体系统调节种子大小方面的研究进展进行了综述,并对其未来的发展进行了展望,为研究种子大小的调控机制及育种改良提供参考。     

泛素/26S蛋白酶体途径在水稻中的生物学功能研究进展

生物体内的蛋白质降解方式有两种,一种不需要能量,一种需要能量。而泛素/26S蛋白酶体途径便是目前已知的依赖ATP、高效、有高度选择性的蛋白降解途径。它介导了真核生物中80%~85%的蛋白质降解,几乎参与到植物生长发育的各个环节,是植物体内蛋白高效专一降解最重要、最精细的调控机制之一。概述了泛素蛋白酶体途径,重点阐述了泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的蛋白结构及其在水稻生长发育、激素信号传导、生物和非生物胁迫响应中的生物学功能及机制,并对进一步研究进行了展望,将有助于揭示泛素/26S蛋白酶体途径在水稻生长发育中的精细调控过程,并为水稻抗逆育种提供了指导和借鉴。     

Force-clamp spectroscopy monitors the folding trajectory of a single protein

We used force-clamp atomic force microscopy to measure the end-to-end length of the small protein ubiquitin during its folding reaction at the single-molecule level. Ubiquitin was first unfolded and extended at a high force, then the stretching force was quenched and protein folding was observed. The folding trajectories were continuous and marked by several distinct stages. The time taken to fold was dependent on the contour length of the unfolded protein and the stretching force applied during folding. The folding collapse was marked by large fluctuations in the end-to-end length of the protein, but these fluctuations vanished upon the final folding contraction. These direct observations of the complete folding trajectory of a protein provide a benchmark to determine the physical basis of the folding reaction.     

1个新水稻组成型启动子的克隆与功能鉴定

根据基因芯片数据库和RT-PCR验证得到1个高活性的水稻组成型表达基因(TIGR Locus:LOC-Os07g34589),用PCR技术从籼稻品种明恢63基因组中克隆得到其上游启动子PSUI1,长度为1 941bp;将其与β-glucuronidase(GUS)报告基因融合构建植物表达载体DX2181b-PSUI1,利用玉米Ubiquitin启动子融合GUS报告基因构建表达载体DX2181b-PUbi作为对照,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将DX2181b-PSUI1和DX2181b-PUbi转化粳稻品种中花11。组织化学染色表明,含DX2181b-PSUI1的转基因植株中,GUS基因在幼苗期叶片、叶鞘、根,抽穗期叶片、叶鞘、茎秆、颖壳、雄蕊和成熟期的叶片、叶鞘、茎秆、胚、胚乳中均有表达,说明PSUI1为组成型启动子。对GUS表达活性进行定量分析表明,PSUI1启动子的活性约为玉米Ubiquitin启动子活性的1/3～1/2,但是PSUI1表现出了更好的表达稳定性。     

玉米Ubiquitin启动子的克隆及功能鉴定

根据Cornejo发表的Ubiquitin启动子的序列,设计引物从玉米自交系18红中克隆出该启动子,测序证明与发表的序列具有98%的同源性,并构建了带有该启动子和GUS基因的植物表达载体,将重组质粒导入农杆菌LBA4404,用农杆菌介导法转入烟草和小麦愈伤中,通过GUS染色反应,证明克隆的启动子在单子叶和双子叶植物中均有活性。     

Recognition dynamics up to microseconds revealed from an RDC-derived ubiquitin ensemble in solution

Protein dynamics are essential for protein function, and yet it has been challenging to access the underlying atomic motions in solution on nanosecond-to-microsecond time scales. We present a structural ensemble of ubiquitin, refined against residual dipolar couplings (RDCs), comprising solution dynamics up to microseconds. The ensemble covers the complete structural heterogeneity observed in 46 ubiquitin crystal structures, most of which are complexes with other proteins. Conformational selection, rather than induced-fit motion, thus suffices to explain the molecular recognition dynamics of ubiquitin. Marked correlations are seen between the flexibility of the ensemble and contacts formed in ubiquitin complexes. A large part of the solution dynamics is concentrated in one concerted mode, which accounts for most of ubiquitin's molecular recognition heterogeneity and ensures a low entropic complex formation cost.