建立胡杨抗逆研究的cDNA-AFLP反应体系

以胡杨为研究材料,建立适用于胡杨抗逆研究的cDNA-AFLP反应体系,对影响反应体系的关键因素(RNA提取、内切酶组合、预扩增体系、选择性扩增体系)进行了探索和优化。结果表明:通过改进后的CTAB法能成功获得高质量的RNA;EcoRⅠ/MseⅠ的组合4.5h内将ds-cDNA酶切完全,与相应接头连接过夜后产物直接用于预扩增;稀释10倍的预扩增产物作为模板用于选择性扩增;通过优化体系得到的选择性扩增产物,银染检测后条带清晰稳定,经RT-PCR检测,证明优化后的cDNA-AFLP技术差异显示的结果可以准确反映基因在植物体中差异表达的真实情况,并利用该技术成功筛选出42对可以获得带型丰富且重复性好的引物组合。     

枣cDNA-AFLP技术体系建立与优化

建立了枣(Ziziphus jujuba Mill.)cDNA-AFLP分析的优化体系和反应程序。提取获得的总RNA以人工合成的Oligo(dT)18为引物,利用鼠源反转录酶(M-MLV RT)合成cDNA第1链,合成双链cDNA后用限制性内切酶EcoRⅠ(识别6个碱基位点)与MseⅠ(识别4个碱基位点)酶切,酶切连接后,使用与接头序列互补的预扩引物对cDNA片段池进行PCR扩增,扩增后的cDNA池定量至1 ng/μL,作为选择性扩增的模板,优化得到的选扩反应体系为:20μL的反应体系中含5μL模板,2μL 10×PCR buffer,2μL MgCl2(25 mmol/L),EcoRⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,MseⅠ特异性引物(50 ng/μL)1μL,10 mmol/L dNTP0.4μL,5 UTaqDNAPolymer-ase 0.12μL。选扩程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,65℃退火30 s(每个循环降0.7℃),72℃延伸1 min,13个循环;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸1 min,31个循环;72℃7 min。     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

番鸭cDNA-AFLP体系的建立

以番鸭脑垂体为材料,用Trizol法提取总RNA,用Superscipt Ⅱ-RT合成第一链cDNA,RNase H和DNA Polymerase合成第二链cDNA,最后用EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ分步酶切cDNA各2h,经T4连接酶合成双链cDNA,预扩增反应后产物稀释40倍进行选择性扩增反应.经1％琼脂糖电泳及6％变...     

割手密AFLP分子标记技术体系建立与优化

【目的】建立和优化割手密AFLP分子标记技术体系,为割手密遗传多样性分析、遗传图谱构建提供技术支持。【方法】以广西割手密GXS87—16、GXS85．30、GXS79—9、GXS96、GXS112、GXS212为材料,利用改良SDS法提取DNA,并用EcoR I和Mse I酶切,连接接头后,采用正交试验设计对影响预扩增反应和选择性扩增反应的主要成分如Mg^2＋、模板DNA、引物、dNTP、Taq聚合酶浓度进行优化。【结果】样品DNA用限制性内切酶＆0RI和MseI各3u于PCR仪过夜可完全酶切。经正交设计优化,较佳的预扩增体系包含0．4μL dNTPs（20mmol／mL）,1．6μLMg^2＋（25mmol／mL）,2．0μL EcoRI—P（5pmol／mL）,2．0IxLMseI-P（5pmol／mL）,1UTaq酶（1U／μL）,DNA模板稀释10倍;选择性扩增体系包含0．4μL dNTPS（20mmol／mL）,0．8μLMg^2＋（25mmol／mL）,1．0μL EcoR I—AAG（6pmol／mL）,1．0μL Mse I-CAG（6pmol／mL）,3U Taq酶（1U／μL）,DNA模板稀释20倍。以对优化反应体系扩增获得的PcR产物用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染后,可获得清晰的多态性指纹图谱。【结论】建立的割手密AFLP分子标记技术体系具有扩增条带清晰、多态性丰富的特点,可为构建割手密高密度遗传图谱提供技术支持。     

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。     

光皮桦木质部cDNA-AFLP 技术体系的建立及应用

为了挖掘光皮桦材性相关基因,本研究以光皮桦木质部为材料,通过对RNA 的提取、cDNA 的反转录及纯化 的对比分析,以及选扩体系优化等,建立了相应的cDNA-AFLP 体系。结果表明:采用CTAB 和RNAiso 试剂相结合 的方法得到的RNA 质量较好,cDNA 经纯化后选扩效果明显变好。选扩体系为:4.0 μL 预扩产物(稀释40 倍)、1.6 μL 的引物(10.0 mmol/ L)、0.2 μL 的dNTP(2.5 mmol/ L)、0.4 μL 的Mg2 + (25.0 mmol/ L),以及0.2 μL 的Taq DNA 聚合酶(5 U/ μL)。进一步以来自不同木质化茎段的cDNA 为模板,筛选出31 对扩增效果较好的引物组合,同时分 离出一些差异表达的基因片段,经测序后探讨了其在木质化发育过程中可能的功能。      

小麦条锈菌AFLP体系的优化

[目的]优化小麦条锈菌AFLP体系。[方法]以小麦条锈菌大田混合菌系为材料,采用改良CTAB法提取DNA,探索酶切、PCR过程,优化小麦条锈菌AFLP体系,并从64对引物中筛选出稳定、高效的引物组合。[结果]改良CTAB法有较好的破壁效果,所提DNA纯度高,条带清楚,无污染,适合AFLP操作。酶切3.0、3.5 h的效果相同,扩出的片断在100~2 000 bp,可进行预扩。TaqDNA聚合酶为0.5 U时,电泳图中出现了较亮的条带,片断大小在100~2 000 bp。16对引物组合可以扩增出较稳定的条带。[结论]优化的小麦条锈菌AFLP体系为:25.0μl酶切体系,37℃酶切3.0 h,10.0μl连接体系在22℃条件下连接过夜,连接产物、预扩产物分别按1∶10、1∶30的比例用ddH2O稀释后用于预扩和选择性扩增。     

施用不同类型黄腐酸对塔里木盆地密植骏枣产量和品质的影响

为了验证不同类型黄腐酸对骏枣产量及品质的影响,本试验选取4种不同类型的黄腐酸产品与常规施肥和不施肥处理做对比。结果表明：各黄腐酸处理与常规施肥(CF)相比,骏枣产量均高于CF,其中TFS处理产量最高,与CF相比增产幅度达35.6%(P<0.05)。不同黄腐酸处理的红枣维生素C、可溶性糖含量、糖酸比和可溶性蛋白质含量均高于CF,其中FA+70%CF处理维生素C含量最高,增幅95.4%(P<0.05),TFS处理可溶性糖和糖酸比显著优于CF,增幅分别为15.5%和53.1%(P<0.05),蛋白质含量除FA外,均显著优于CF。制干率均高于CF,其中FA+70%CF、TFS、BFA+70%CF处理红枣制干率显著高于CF处理(P<0.05),增幅分别为9.9%、9.6%、8.5%。不同黄腐酸处理下红枣收入均显著高于CF(P<0.05),增幅为20.8%～35.7%,产投比均显著高于CF处理(P<0.05)。由此说明,不同类型黄腐酸对红枣产量和品质提升均有促进作用,推荐施用黄腐酸磷酸二氢钾复合肥1 500kg/hm²。     

薏苡AFLP体系的建立与优化

以30个不同薏苡种质为试验材料,利用AFLP分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系的研究。通过对AFLP常规流程中（基因组提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳及银染检测）关键因素进行优化,建立适合薏苡的AFLP扩增检测体系。结果表明,采用酶切与连接分开的两步法,酶切完全,每步反应时间4 h并附加15 min的酶失活时间;连接产物稀释10倍;预扩增产物稀释50倍,试验效果最佳。应用优化后体系,从64对引物中筛选出14对多态性较好的薏苡AFLP选择性扩增引物。     

Occurrence and pathogens of fruit shrink disease in Ziziphus jujuba Mill.

The occurrence of fruit shrink disease in Ziziphus jujuba Mill. ‘Linyilizao’ was investigated from 2006 to 2009 in Cangxian of Hebei Province, Taiyuan, and Taigu of Shanxi Province, and the pathogens were isolated from the diseased fruits sampled from both Cangxian and Taiyuan in 2006 and 2007. The pathogens in leaf, fruit, and shoot collected from Cangxian were isolated from June to October in 2008 at 30-day intervals. The incidence of the disease varied significantly with location and year, and the highest incidence was observed in Cangxian during 2006. Three kinds of key pathogens were isolated from the fruits from July to September, i.e., Alternaria alternata Keissler (mainly in July), Phoma destructiva Plowr. (mainly in September), and Fusicoccum sp., of which A. alternata was the most dominant. In leaves, both A. alternata (much more dominant) and P. destructiva could be isolated throughout June to October, but no Fusicoccum sp. was found. At the white-ripening stage of fruit, the isolation rate of A. alternata was the highest in leaves (36.67%), followed by extension shoot (6.67%) and fruit (1.11%) while that of P. destructiva was the highest in extension shoot (31.11%), followed by fruit (13.33%) and leaf (12.22%), with Fusicoccum sp. isolated only in extension shoot (2.22%). The frequency of isolating two or three kinds of above three pathogens together was very low, with the highest rate (19.30%) found in A. alternata and P. destructiva from leaves in July.     

家猪AFLP分析体系的建立

以大白等6个猪品种为试验材料，建立了家猪扩增酶切片段长度多态性(AFLP)分析体系，对其分析过程中DNA提取、双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、银染效果进行了检测。用E39M48引物组合构建了供试猪的AFLP指纹图谱。条带清晰可辨，扩增信号强，无背景干扰。     

抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建*

 以优质高抗黑胫病的烟草品种K326为材料,在苗期接种黑胫病菌丝,3d后取叶片用Trizol试剂提取总RNA,经电泳检测28S,18S条带清晰,无DNA污染。以总RNA为模板,采用SMART技术合成双链cDNA,其产物主要集中在0.5～3kb之间,最大片段超过3kb。合成的双链cDNA经SfiⅠ（A/B）酶酶切后,用CHROMA SPIN-400层析柱分离分级cDNA,将大于0.5kb的cDNA片段混合,载入λTriplEx2载体,构建成云南第一个烟草cDNA文库。该文库的大小为1.2×10⁷pfu。扩增文库的滴度达到1.2×10⁹pfu/mL。文库的重组率大于94%。取阳性克隆转化为质粒,通过PCR反应检测,重组体确有DNA插入, 其片断大小在0.5～1kb之间。     

泡桐AFLP反应体系的建立及引物筛选

以豫杂一号泡桐为材料,通过对影响AFLP技术体系的各主要因素的研究,建立了适于泡桐AFLP分析的技术体系.结果表明最佳酶切体系(20μL)为500 ng模板DNA,3 U的Pst 1和Mse I,在37℃下双酶切3 h;20μL最佳连接体系中为酶切产物15 μL,0.25 μmol·L-1Pst I接头,2.5 μmol·L-1 Mse I接头,1 μL 10×T4 Buff-er,2 U T4连接酶,22℃连接18 h;20 μL最佳预扩反应体系中5 μL稀释10倍的连接产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,250 μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.20 μL最佳选择性扩增反应体系中5 μL稀释20倍预扩增产物,100 μmol·L-1dNTP,2 U Taq酶,350 μmol·L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGT/M+AGT),2 μL 10×PCR Buffer.最后,筛选出了97对适宜于泡桐AFLP分析的引物.     

Acquirement of a new male sterile germplasm of Chinese jujube

A male sterile germplasm of Chinese jujube (Ziziphus jujuba Mill.), named ‘male sterile No.1’ (JMS1), was firstly identified from a natural population through studies of pollen amount and vitality and its anatomy. Its microspores got massed and then disaggregated after the tetrad stage during pollen development. Then its anthers became empty, or only pollen vestiges remained in the yellow buds. The pollen became abortive after the tetrad stage. Hypertrophy and hyperplasia of tapetum at the tetrad stage were related to pollen abortion. In view of its moderate embryo fertility, big fruit-size and early maturing, ‘JMS1’ could be used as a worthwhile female parent in the cross breeding of Chinese jujube. __________ Translated from Acta Horticulturae Sinica, 2006, 33(2): 374–377 [译自: 园艺学报]     

不同类型灵武长枣果实多糖的单糖成分差异

为分析大果型、枣刺退化型、早熟型和普通型4种不同类型灵武长枣完熟期果实多糖中单糖成分的差异,经水提醇沉法提取、采用DEAE-cellulose52和HW-55S分离纯化,利用GC-MS等分别对果实进行多糖的单糖成分分析研究。结果表明:1)不同类型果实粗多糖得率分别为:普通型1.795%,大果型1.504%,早熟型0.999%,枣刺退化型0.956%,粗多糖含量从高到低依次为:普通型早熟型大果型枣刺退化型。2)不同类型果实粗多糖经DEAE-52柱层析,均得到1个中性级分(Ju-0)和3个酸性级分(Ju-1、Ju-2、Ju-3),其中Ju-2含量均为最高,表明果实多糖的主要形式为酸性多糖,但4个多糖级分的质量和得率差异显著。3)不同类型果实精制多糖含量因级分不同而差异较大,Ju-0和Ju-3级分均为普通型中最高,Ju-1级分在大果型中最高,Ju-2级分在早熟型中最高。4)不同类型果实精制多糖均以阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖含量较高,葡萄糖含量次之,甘露糖和木糖含量较低,均不含有果糖;NIST谱库显示,果实精制多糖中还含有核糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。因此,不同类型灵武长枣果实多糖中单糖成分相似,但其成分和含量因级分不同而差异较大。     

基于毛细管电泳的柳树AFLP分子标记研究

为构建柳树遗传图谱、进行分子育种等奠定基础,以柳树为材料,基于毛细管电泳技术体系建立并优化了AFLP分子标记技术,简化了AFLP分析流程。首先提取高质量的柳树基因组DNA,对基因组进行酶切与接头连接、预扩增和选择性扩增,最后通过毛细管电泳分析各因素的影响。基因组DNA提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量450 ng,EcoRⅠ酶切2 h,MseⅠ酶切2 h,接头过夜连接,选择性扩增时dNTP浓度0.3 mmol/L,Mg 2+ 浓度1.5 mmol/L,引物浓度0.125 μmol/L,DNA聚合酶浓度0.025 U/μL,预扩增产物最适稀释倍数20倍。经过重复实验,证明建立的AFLP 毛细管反应体系适用于柳树AFLP分析。      

披碱草属物种AFLP体系优化

试验对内切酶EcoRⅠ和MseⅠ的用量和酶切时间、预扩和选扩过程中模板稀释倍数以及扩增引物浓度分别进行了优化,并采用了Bassam法和Sanguinetti银染法进行了比较分析。结果表明:采用3UEcoRⅠ和MseⅠ这两种酶在37℃下酶切3 h,预扩模板稀释10倍和1.5 ng/μL引物进行预扩,选扩模板稀释20倍和2 ng/μL引物进行选扩,采用Bassam法进行银染,能够得到较好的试验结果,为AFLP进一步在披碱草属中的应用提供了参考。     

干旱胁迫下梨枣抗旱性研究

为探索陕北黄土丘陵区梨枣的抗旱性与耐旱能力,以大规格盆栽梨枣（Ziziphus jujuba Mill.cv.Lizao）2年生苗木为试验材料,在连续不供水情况下研究了梨枣的萎蔫到致死过程。依据干旱缺水后枣树生长衰退过程中的特征将枣树萎蔫致死分为：暂时萎蔫、初始萎蔫、表征永久萎蔫及耐旱致死四个阶段。结果表明：梨枣的初始萎蔫系数在2.017%～3.054%之间,平均为2.494%;表征永久萎蔫系数在1.199%～1.998%之间,平均为1.489%,永久萎蔫系数在1.250%～1.489%之间;耐旱致死点为1.250%,致死时间为135±11 d。试验结果证明枣树是一种十分抗旱的树种,在半干旱黄土丘陵区枣树不会出现干旱致死。     

芸芥果胶酸裂解酶基因的克隆及序列分析

采用RACE技术从芸芥自交亲和系花药中克隆出果胶酸裂解酶(Pectate lyases,PL)基因,全长1 657bp,其完整开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1 371bp,编码456个氨基酸,分子质量51.179ku,等电点9.42。序列比对结果表明,该蛋白与其他植物的PL蛋白具有较高的同源性,因此命名为EsPL。进化树分析表明,芸芥EsPL基因与十字花科芸薹属植物甘蓝型油菜、白菜型油菜的PL基因亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果显示,EsPL在芸芥开花后自交亲和系花药中的表达量显著高于自交不亲和系花药中表达量,该基因可能在芸芥自交亲和性状调控过程中发挥重要作用。