羊源布氏杆菌LpxA基因的克隆表达及生物信息学分析

UDP-N-乙酰葡萄胺酰基转移酶(LpxA)是类脂A生物合成必需的早期酰基转移酶。为了克隆和原核表达羊源布氏杆菌的LpxA基因, PCR扩增LpxA基因并构建pET-28a(+)-LpxA重组质粒,将鉴定正确的重组质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,对LpxA基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示:成功克隆了837 bp的LpxA基因,诱导表达的融合蛋白大小约为35 ku,蛋白的分子式为C_(1286)H_(2028)N_(388)O_(381)S_(16),分子质量为29 533.58 u,理论等电点为7.32,属弱碱性蛋白;不稳定系数为34.54,属于稳定类蛋白质;疏水指数为83.85,总平均亲水性为-0.067,属于疏水类蛋白;三级结构预测该蛋白为三聚体,属于非分泌蛋白。本研究为进一步阐明羊源布氏杆菌感染宿主过程中自身的免疫逃避的机制及其抑制剂研发提供新的理论依据。     

一株布氏乳杆菌的分离、鉴定及其特性研究

为寻找抗性菌,以替代部分抗生素,并研究其特性,试验以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌为指示菌,采用牛津杯法从传统发酵食品中筛选出1株对3种病原菌均具有拮抗作用的菌株。利用菌落形态、革兰氏染色、16SrDNA序列分析来鉴定菌株,并测定其生长曲线。结果显示,试验筛选得到了1株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌均具有抑制作用的益生菌,经鉴定为布氏乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)。此分离菌为革兰氏阳性菌,单生或成对生长。此菌在抑菌方面具有良好的应用前景。     

巢式PCR检测乳中布氏杆菌

本研究建立了检测乳中布氏杆菌omp22基因的巢式PCR方法,经过反复操作验证该检测方法有较好的重复性和稳定性。对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、棒状杆菌、绿脓杆菌等羊常见菌及羊基因组检测阴性,表明此方法有很好的特异性。该方法有较强的敏感性,羊乳中布氏杆菌的检测灵敏度可达到40CFU/mL乳汁。     

羊布氏杆菌病的检测与防制

布氏杆菌病(简称布病)是一种人畜共患的传染病，此病严重影响着畜牧业的发展与人体的健康。新疆石河子紫泥泉种羊场从60年代起在全场范围内进行了布氏杆菌病的检疫工作。自1962～2003年共检测羊286229只，呈现阳性的890只，经过多年的检测，扑杀与防制，到80年代末已基本控制了本病的发生与流行。     

布氏杆菌病概况及其研究进展

1 布氏杆菌病概况 布氏杆菌病(brucellosis)是一种全世界广泛分布的人兽共患慢性细菌传染病。布氏杆菌(Brucella)可感染人类、多种家畜和野生动物,引起相似的临床症状与病理损伤,如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等,导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。家畜布氏杆菌病最常发生于羊、牛和猪。早在五十年代,布氏杆菌即为美军成功研发的第一个细菌战武器,因此也是生物反恐的一个重要潜在对象。 布氏杆菌传统上根据其宿主倾向性和危害性进行分     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

青海省乌兰县牛羊布氏杆菌病调查

利用虎红平板法和试管凝集反应,对采自乌兰县铜普镇、希里沟镇、柯柯镇和茶卡镇4个镇的奶牛血清249份,1630份种公羊血清,进行布氏杆菌病血清抗体的监测,对检出的阳性和可疑血清通过复检,最终掌握牛羊布氏杆菌病的感染情况,有的放失地采取综合防治。     

犬布氏杆菌Cu/Zn-SOD基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为检测犬布氏杆菌(Brucella canis)重组Cu/Zn-SOD蛋白的抗原性,本研究通过PCR方法扩增B.canis的Cu/Zn-SOD基因,将其克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-SOD.将该质粒转化受体菌E.coli BL21 (DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳分析,...     

猪囊尾蚴抗原基因Ts11的克隆及其在大肠杆菌的表达

PCR扩增重组噬菌体λTs11克隆的cDNA片段,与pUC18连接,得到的重组子用以测序,并进行同源性比较分析,将该片段克隆到原核表达载体pGEX-1λT中,免疫印迹筛选得到能正确表达该片段的重组子,制备该和理组子在大肠杆菌中的表达产物,进行浓度梯度SDS-PAGE和West-ern blotting分析,结果表明Ts11 cDNA片段为522 ,编码含139个氨基酸残基的多肽,在Gen-Bank和EMBL数据库均未发现同源序列,重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为41KD,能与免抗猪囊尾蚴囊液血清产生很强的免疫反应,这些结果证实分离到一个新的编码具有较强免疫原性猪囊尾缦抗原的 DNA克隆..λλ     

刚地弓形虫抗原基因SAG2的克隆、表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层析柱进行纯化。结果经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为41KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗弓形虫血清特异性结合。培养基2×YTA,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间3 h,培养温度30℃,摇瓶转速220 r/min是GST-SAG2融合蛋白表达的最佳条件,且得到的是可溶性融合蛋白GST-SAG2。结论得到高效表达的SAG2抗原蛋白,为建立弓形虫病快速免疫诊断试剂盒打下基础。     

牛生长激素释放因子类似物基因的克隆与表达

本研究以近期报道的高生物学活性、高代谢稳定性的牛生长激素释放因子类似（Ｉｌｅ＾２,Ａｌａ＾１５,Ｌｅｕ＾２７）ｂＧＲＦ（１－２９）－ＮＨ２的氨基酸序列为模板,选用大肠杆菌高效表达所偏爱的密码子设计出该基因的全序列。采用化学合成法合成两个３’末端有１９碱基互补的８０碱基的寡核苷酸片段。并互为模板和引物,通过酶促延伸合成完整的ｂＧＲＦ类似物基因,克隆于ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ中,通过蓝／白筛     

镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30基因的克隆及原核表达

根据丝氨酸蛋白酶保守性氨基酸序列设计引物,以镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA为模板,经PCR扩增得到SP30基因的保守区,通过5’RACE(rapid amplification of cDNA Ends)和3’RACE技术得到全长基因。将该基因连入原核表达载体pGEX-4T-1,经IPTG诱导纯化得到重组蛋白。以镰形扇头蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱各发育阶段的cDNA为模板进行Real-timePCR实验。结果显示,SP30基因全长1194 bp,开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,预计蛋白分子质量30 kDa。Real-time PCR分析结果表明,该基因在四个不同的发育阶段均有不同程度的表达。     

马泰勒虫新疆株EMA2基因的克隆及原核表达

裂殖子表面抗原蛋白家族因其高抗原保守性常作为马泰勒虫ELISA检测方法的基质。本研究根据马泰勒虫EMA2基因序列合成引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板,扩增获得目的基因,将其连接至pEASY-E1载体构建重组质粒pEASY-E-TE,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组EMA2蛋白并鉴定。结果显示:PCR扩增获得了约819bp特异性DNA片段,构建了pEASY-E-TE重组质粒,成功诱导表达了35kDa的可溶性目的蛋白;经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白rEMA2具有良好的抗原性。本试验克隆表达的重组蛋白rEMA2可为ELISA方法的建立及后期研究提供靶基因材料。     

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ(TnI)的cDNA并进行表达及鉴定。方法用RT-PCR方法从镰形扇头蜱总RNA中克隆编码肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段,将该cDNA连接到pET-32a( )表达载体,并转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western blot分析。结果获得镰形扇头蜱的eDNA,并在大肠杆菌中以包含体的形式高效表达,Westem blot分析表明,抗TnI重组蛋白兔血清可以识别蜱体内的TnI,并在22 kDa和36 kDa之间有两条带。结论蜱体内可能同时存在两个大小不等的TnI,为进一步的研究打下基础。     

镰形扇头蜱-新基因的分离、克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

目的分离、克隆镰形扇头蜱一新基因。方法本实验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的100个EST（Expressed Sequence Tag）序列中选取一个带有polyA尾的序列，经5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）得到此序列的全长基因，命名为RhHp2，基因全长1002bp，开放阅读框（ORF）从31bp至879bp，共848bp，编码282个氨基酸。经序列比较，RhHp2基因与其它序列在核苷酸水平上基本无同源性，但在氨基酸水平上与其它物种同源性最高可达50．81％。RhHp2基因连接于PET32a（＋）载体后克隆于表达菌B121，1mM IPTG诱导表达，产生分子量约为55kD的融合重组蛋白，并以不溶性包涵体形式存在。经纯化和体外复性的重组蛋白三次免疫新西兰兔后，将镰形扇头蜱未吸血成蜱和若蜱接种于此免疫兔耳，并对接种48h后的蜱上体数、蜱的饱血数量、饱血时间、饱血重量等进行记录。结果发现蜱的吸血行为受到一定影响，若蜱在48h的减虫率（上体数减少）为58％，在整个吸血过程中的死亡数增加，成蜱的饱血体重显著降低。结论此结果表明RhHp2基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。     

猪大肠杆菌热敏肠毒素B亚基基因的克隆及高效表达

本文以多聚酶链反应扩增得到的ＬＴＢ基因ＤＮＡ片段为探针，克隆了含猪源大肠杆菌ＬＴＢ基因的７７５ｂｐＨｉｎｄⅢ酶切片段，对插入片段进行了核苷酸序列测定：将含ＬＴＢ基因的ＥｃｏｒⅠ－ＨｉｎｄⅢ酶切片插 达载体ｐＫＫ２２３－３中得到亚克隆     

猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插     

日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)基因的克隆表达及其免疫保护效果分析

为了评估日本血吸虫还原性辅酶I(SjNADH)在小鼠体内诱导的免疫保护效果,应用PCR获得SjNADH基因片段,其开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸,并在大肠杆菌中成功表达,纯化得到该重组蛋白。Western blot结果显示,SjNADH在日本血吸虫童虫和成虫中的表达量稳定,SjNADH融合蛋白也能被免疫血清识别,具有较好的免疫原性。应用重组蛋白免疫小鼠能诱导产生较高的特异性抗体水平,并诱导了20.13%的减虫率和23.06%的肝脏减卵率。结果表明,获得的SjNADH重组蛋白在小鼠体内诱导产生了部分免疫保护,有作为血吸虫疫苗候选抗原分子的潜力。