Cry1Ab13杀虫基因的PCR诱变及功能验证

【目的】通过易错PCR技术克隆一种新的Cry1Ab13基因,以利用Cry类Bt基因提高作物抗虫性,丰富基因资源。【方法】利用易错PCR技术对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab13基因进行随机诱变,构建突变体文库,筛选获得突变株Cry1Ab13-1,将该基因构建原核重组表达载体后转化到大肠杆菌中进行异源表达,并利用表达的目的蛋白进行抗虫鉴定。【结果】序列分析表明,突变株Cry1Ab13-1基因序列全长2 036bp,与原始碱基序列的一致性为97.79%,有2个碱基发生突变,导致该基因编码的氨基酸序列中有2个氨基酸改变,分别是第130位由脯氨酸变成丝氨酸,第383位由丝氨酸变成苏氨酸;改变后的氨基酸序列与原始氨基酸序列一致性为96.97%。在线分析表明,该基因与已知过敏源的序列同源性低于35%,不存在致敏性。SDS-PAGE电泳分析表明,表达蛋白分子质量大小为79.5ku,与预期结果相符。抗虫鉴定表明,处理72h时表达的目的蛋白对小菜蛾(Plutella xyllostella)幼虫的致死率达87.88%,明显高于未突变基因对照组的幼虫死亡率;对亚洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼虫的致死率达81.11%,而且存活的亚洲玉米螟幼虫的生长发育受到明显抑制。【结论】成功克隆了Cry1Ab13-1抗虫基因,且该基因对小菜蛾幼虫和亚洲玉米螟幼虫均具有高效的杀虫活性。     

鲤鱼春季病毒血症病毒磷蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】将拟南芥叶绿体发育必需蛋白PAC进行大肠杆菌原核表达和纯化,并免疫家兔,获得针对PAC蛋白的多克隆特异性抗体,为进一步研究PAC蛋白在叶绿体发育中的功能提供保证。【方法】将编码拟南芥PAC蛋白的cDNA克隆至原核表达载体pET-28a中,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PAC蛋白进行镍柱亲和纯化和SDS-PAGE割胶纯化,并将纯化的PAC蛋白通过皮下注射免疫家兔,利用分离得到的抗血清,针对拟南芥野生型、PAC敲除突变系pac-1和PAC过表达系PACOE的总蛋白进行免疫印迹检测。【结果】成功构建了拟南芥基因PAC的原核表达载体pET-28a-PAC,在37℃、1mmol/L IPTG诱导4h的大肠杆菌细胞中,可检测到分子质量为38.9ku的重组蛋白,其大部分以可溶形式存在。用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得PAC抗血清,该抗血清能够有效地检测出1ng原核表达的PAC重组蛋白,并在植物样品中检测出1条分子质量约为35ku的条带。【结论】成功制备了PAC蛋白的多克隆抗体,可用于植物中PAC蛋白含量的检测。     

兔岩藻糖基转移酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆兔岩藻糖基转移酶(FUT2)基因,并进行原核表达,为进一步研究RHDV的感染过程和致病机理奠定物质基础。【方法】从兔肌肉组织中抽提基因组DNA作为模板,PCR扩增出FUT2基因,然后将该基因亚克隆入原核表达载体pET30a中,获得重组原核表达质粒pET30a-FUT2。将该重组原核表达质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了FUT2基因,该基因长度为1 044 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET30a-FUT2,其诱导表达产物分子质量约为45 ku;表达的重组FUT2蛋白可与His标签抗体发生抗原抗体反应。【结论】成功克隆了兔岩藻糖基转移酶基因,获得了分子质量约为45 ku的FUT2蛋白。     

家蚕Bmugt3基因cDNA序列的克隆、表达与序列分析

【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。     

苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

【目的】从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础。【方法】根据Genbank中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序。然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳。对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测。【结果】苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275基因的原核表达与鉴定

【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-28a,构建表达重组质粒pET-28a-BPE123和pET-28aBPE275,在大肠杆菌中进行诱导表达,Western blot分析重组蛋白His-BPE123和His-BPE275的免疫学特性。【结果】PCR扩增获得了462bp的BPE123基因片段和762bp的BPE275基因片段,成功构建了pET-28a-BPE123、pET-28a-BPE275原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BPE123和BPE275蛋白,经SDS-PAGE检测,重组融合蛋白BPE123、BPE275的分子质量分别约为22和31ku,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别表达的蛋白。【结论】克隆了分泌蛋白BPE123、BPE275基因片段,并成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275。     

梨小食心虫普通气味结合蛋白2（GmolGOBP2）cDNA的克隆与原核表达

【目的】克隆梨小食心虫(Grapholita molesta)普通气味结合蛋白2(GmolGOBP2)的全长cDNA序列并进行原核表达,为研究该蛋白在梨小食心虫化学感受系统中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆GmolGOBP2的全长cDNA序列,并使用原核表达载体pET-32a在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,用SDSPAGE和Western blot检测其表达情况。【结果】GmolGOBP2的cDNA全长序列为637bp(GenBank登录号:JN857940),开放性阅读框长度为483bp,编码161个氨基酸残基,成熟蛋白分子质量为15.98ku,等电点为4.85。GmolGOBP2预测蛋白的N末端具20个氨基酸残基组成的信号肽序列,并且氨基酸序列中具有6个保守半胱氨酸的典型气味结合蛋白家族标志。将GmolGOBP2编码序列重组到表达载体pET-32a中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,梨小食心虫普通气味结合蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出分子质量约为32ku的融合蛋白,与预测的融合蛋白分子质量大小一致。【结论】克隆并原核表达了GmolGOBP2的cDNA序列,可用于研究该蛋白分子结构及其在化学感受系统中的功能。     

鸡PLA2基因的克隆与原核表达及PLA2蛋白卵黄抗体的制备

【目的】克隆并原核表达鸡PLA2基因,小量制备鸡PLA2卵黄抗体,为大规模制备PLA2卵黄抗体作为饲料添加剂提供参考。【方法】提取鸡胰脏总RNA,利用RT-PCR方法获得鸡PLA2基因,将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建表达载体pGEX-4T-1-PLA2,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-PLA2融合蛋白。将GST-PLA2融合蛋白免疫青年蛋鸡,每次0.3mg/只,共免疫4次,收集鸡蛋,提取卵黄抗体,采用West-ern Blotting检测抗体的特异性。【结果】成功克隆出了鸡PLA2基因,构建了pGEX-4T-1-PLA2原核表达载体,并诱导表达了分子质量为44.59ku的GST-PLA2融合蛋白。GST-PLA2融合蛋白免疫蛋鸡后获得了卵黄抗体,经West-ern Blotting检查,制备的卵黄抗体具有很好的特异性。【结论】构建了表达鸡PLA2基因的表达系统,并成功的制备了抗鸡PLA2的卵黄抗体。     

植物外源基因转移技术综述

本文对植物外源基因转移方法和研究进展进行了综述,并对常用的选择标记基因、报告基因以及植物遗传转化中存在的问题进行了分析。     

浅析抗虫基因种类及抗虫原理

概述了目前植物抗虫基因工程中应用较广的Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因、淀粉酶抑制剂基因和动物源抗虫基因及抗虫原理,分析了抗虫基因植物面临的问题,提出了延缓害虫对转基因植物抗性的解决建议。     

Design and Implementation of Visual Dynamic Display Software of Gene Expression Based on GTK

The paper presented an implement method for a dynamic gene expression display software based on the GTK. This method established the dynamic presentation system of gene expression which according to gene expression data from gene chip hybridize at different time, adopted a linearity combination model and Pearson correlation coefficient algorithm. The system described the gene expression changes in graphic form, the gene expression changes with time and the changes in characteristics of the gene expression, also the changes in relations of the gene expression and regulation relationships among genes. The system also provided an integrated platform for analysis on gene chips data, especially for the research on the network ofgene regulation.     

阿勒泰羊羔羊MSTN/Smad信号通路基因在不同组织的表达研究

[目的]研究MSTN/Smad信号通路基因在阿勒泰羊2日龄羔羊不同组织中的表达程度的差异.掌握阿勒泰羊2日龄羔羊MSTN/Smad信号通路基因表达规律.[方法]采用荧光定量PCR技术(QRT-PCR)分析阿勒泰羊2日龄羔羊MSTN/Smad信号通路基因在不同组织中的表达量.[结果]背最长肌MSTN mRNA表量显著高于股三头肌、股二头肌、半腱肌和半膜肌(P＜0.05),各组织Smad2 mRNA表达量无显著差异(P＞0.05).Smad3 mRNA在股二头肌、半腱肌、背最长肌和脾中的表达量显著高于肺中的表达量(P＜0.05).Smad4 mRNA在心脏中的表达显著高于肺脏中的表达量(P＜0.05).TGFBR1 mRNA在心脏中的相对表达量为最高.TGFBR2 mRNA在心脏、脾脏、肾脏、肝脏中的表达量显著高于股二头肌肉中的表达量(P＜0.05).[结论]对阿勒泰羊2日龄羔羊MSTN/Smad信号通路基因在不同组织中的表达进行了初步的研究,这对今后阿勒泰羊MSTN基因表达规律及调控的研究具有重要意义.     

基因芯片技术及其应用

基因芯片是一种高通量、快速、平行核酸序列测定及定量分析技术。它是将大量特定序列的核酸片段有序地固定在载体上作为探针与标记核酸分子进行杂交,检测杂交信号的强弱,进而判断样品中靶分子的组成及数量。目前基因芯片技术广泛应用于基因序列测定、基因表达研究、动植物疾病诊断及生物药物筛选等领域,是一种发展前景良好的新兴检测手段。文章介绍了基因芯片技术的概念、工作原理、种类和制备过程,重点介绍了该技术在基因测序,基因表达水平检测,基因多态性检测,药物筛选,以及在预防兽医中的应用。     

新疆巴什拜羊不同毛色与有关基因多态性分析

【目的】以不同毛色(红棕色73只,黑色53只,青灰色40只)新疆巴什拜羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术检测ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性,并分析其与被毛表型的相关性。【方法】采用随机抽样的方法选取出三种毛色的巴什拜羊,用枸橼酸钠抗凝管进行采血。运用软件PIC-CALC和POPGENE 32计算巴什拜羊ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的多态信息含量和基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度、有效等位基因数,并对该位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方检验。将所得数据输入Excel表中进行整理,并用SPSS 19.0软件进行差异性分析。【结果】ASIP基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型和AB型,等位基因B为红色被毛群体中的优势等位基因;等位基因A为黑色和青灰色两种被毛群体中的优势等位基因。处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),红色被毛多态信息含量处于中度多态,而黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYR基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型、AG型和GG型,等位基因G为3种毛色的优势等位基因TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而红色被毛群体中处于不平衡状态(P<0.05)。TYRP1基因存在两种基因型:AA型和GG型,等位基因A为红色和青灰色两种毛色的优势等位基因;等位基因G为黑色被毛群体的优势等位基因。TYRP1基因在巴什拜羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。红色被毛多态信息含量处于高度多态,黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYRP2基因PCR-SSCP检测结果没有显示多态。【结论】ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性与巴什拜羊的毛色性状有相关性。     

转基因玉米的定性PCR检测

根据玉米内参照基因zSSIIb和转基因玉米中常见的CaMV35S、NOS、Bt、hpt等基因的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地将转基因玉米的目的基因检出,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性。由此建立了一套转基因玉米定性PCR检测方法,用于转基因玉米及其产品的筛查、抽检。     

禽类生长激素受体基因研究进展

生长激素受体(GHR)是促乳素、生长激素、细胞因子、促红细胞生成素受体超家族成员之一,它与生长激素(GH)结合可对禽类生长发育起到调节作用.目前有关禽类GHR的研究多集中在正常鸡和矮小禽类之间GHR的变异上.本文就鸡GHR基因结构与表达、多态性与生产性能的相关等研究进行了综述和讨论.     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。