磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。     

小菜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾(Plutella xylostella)3龄幼虫的cDNA为模板,克隆获得泛素延伸蛋白基因Px-ubi(GenBank No.FJ527489),核苷酸序列全长537 bp,其中开放阅读框全长387 bp,编码129个氨基酸残基,预测分子质量为16.7 ku,等电点为9.1,与...     

菠菜硝酸还原酶基因的克隆与原核表达

利用RT-PCR技术从低富集硝酸盐的菠菜品种中克隆得到硝酸还原酶(NR)基因,并进行了同源性分析;构建该基因的原核表达载体pET-NR,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,为深入研究并揭示菠菜的硝酸盐富集机制奠定了基础.结果表明:获得的NR基因包含完整的开放阅读框(2 781 bp),编码926个氨基酸,与菠菜、甜菜NR核苷酸序列的同源性分别为99％、80％,与其氨基酸序列的相同性分别为99％、86％.SDS-PAGE电泳显示重组菌经IPTG诱导表达出104 ku左右的蛋白质,与预期大小一致.     

人瘦素基因的克隆及原核表达

通过RT-PCR从人的脂肪组织中克隆了人OB基因,并将其在原核生物E.coli BL21(DE3)中重组表达,采用SDS-PAGE法检测表达情况,鉴定表达产物。结果表明,人瘦素在大肠杆菌中表达量占总蛋白的20%左右,为瘦素的进一步研究奠定了基础。     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

淇河鲫生长激素基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析淇河鲫生长激素(Growth hormone,GH)基因,并进行原核表达。【方法】采用RT-PCR方法对淇河鲫GH基因cDNA进行克隆,对其序列进行分析,并构建其原核表达载体PQE30-GH,进行原核表达。【结果】淇河鲫GH基因长633 bp,与鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼具有较高的同源性,且处于同一进化分支上;与胡子鲇、鳗鲡、家鼠和人等的同源性较低。构建的表达载体PQE30-GH含有GH基因完整的阅读框架(ORF),转化到大肠杆菌DH5α中,经终浓度0.1 mol/L IPTG诱导后成功地表达出24 ku的融合蛋白。【结论】淇河鲫GH基因克隆成功。淇河鲫GH基因可以在原核中诱导表达,但表达量较低。     

茶树花色素还原酶基因的克隆与原核表达

采用RACE技术,从茶树新品系"1005"的嫩芽中克隆出ANR基因的全长cDNA(1260 bp),其推导的氨基酸序列与茶树、葡萄花色素还原酶的一致性分别为99%和84%;并成功构建了ANR基因的原核表达载体pET-ANR,在大肠杆菌BL21中表达出预期大小(约45 ku)的融合蛋白.     

绵羊CD58基因的克隆与原核表达

通过对猪、绵羊CD58mRNA序列比对,设计出绵羊CD58的特异性引物,应用反转录PCR技术从绵羊淋巴细胞mRNA中扩增出绵羊CD58基因,将该基因克隆到原核表达载体pGEX4-1中进行原核表达.结果表明:克隆出的绵羊CD58cDNA长807bp,其中包含了开放式阅读框;该基因在大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE电泳在53ku处能观察到特异表达的融合蛋白,产物通过Western-blot检测证实,可以被CD58单克隆抗体识别.     

板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

曼陀罗水提取物对小菜蛾的拒食及毒杀活性

为比较有毒植物曼陀罗及其变种紫花曼陀罗对小菜蛾的杀虫生物活性,采用室内生测方法,分别测定曼陀罗及其变种紫花曼陀罗种子、茎杆、叶片、果壳水提取物对3龄小菜蛾幼虫的取食、存活及生长发育等的影响。结果表明,供试曼陀罗及其变种紫花曼陀罗各器官的水提取物对小菜蛾幼虫均表现出一定的生物活性,且以拒食活性表现最为明显;紫花曼陀罗的拒食和胃毒活性均高于曼陀罗;就供试材料各器官比较而言,曼陀罗的种子水提取物活性最高,而其变种紫花曼陀罗则是茎杆水提取物的活性最高。大量废弃的紫花曼陀罗茎杆有待开发为植物源杀虫剂。     

沙冬青茎杆甲醇提取物对小菜蛾幼虫生长发育的影响

室内测定了沙冬青茎杆甲醇提取物对小菜蛾幼虫生长发育的影响。结果表明,沙冬青茎杆甲醇提取物对小菜蛾幼虫生长发育具有明显的抑制作用。幼虫取食处理叶片后,体重增加较缓慢。而且随浓度的升高,这种体重抑制作用越强,最终导致高浓度处理中幼虫死亡较多。幼虫取食量、排粪量、食物近似消化率(AD)、食物利用率(ECI)、食物转化率(ECD)、相对生长率(RGR)、相对日均体重增长率(MRGR)均随提取物浓度的增加而降低。沙冬青茎杆甲醇提取物对小菜蛾幼虫历期的影响不明显,但使蛹期延长,幼虫死亡率升高。     

5%去甲斑蝥素微乳剂对小菜蛾杀虫活性研究

【目的】明确5%去甲斑蝥素微乳剂对小菜蛾的田间防治效果。【方法】采用浸叶法,测定了5%去甲斑蝥素微乳剂对小菜蛾的室内毒力;选用不同剂量5%去甲斑蝥素微乳剂和不同施药时期进行田间防治试验,观察该药剂对小菜蛾的田间防治效果。【结果】5%去甲斑蝥素微乳剂对小菜蛾3龄幼虫具有较高毒力,24h的致死中浓度(LC50)为85.10mg/L。在田间施用剂量为111.11~138.89g/hm2时,5%去甲斑蝥素微乳剂对小菜蛾药后7d的防效可达90%以上;进一步用111.11g/hm2 5%去甲斑蝥素微乳剂在小菜蛾不同龄期施药,结果表明,在1龄幼虫盛发期施药药效最好,7d后对小菜蛾的防效可达90.96%。【结论】5%去甲斑蝥素微乳剂在室内和田间对小菜蛾均具有很好的控制效果,具有防效高、持效时间长和安全等优点,有产业化开发前景。建议在甘蓝处于包心初期施用5%去甲斑蝥素微乳剂,施用剂量以111.11g/hm2为宜。     

东亚钳蝎对小菜蛾的捕食效应

在实验室条件下,研究东亚钳蝎对小菜蛾的捕食效应。结果表明,东亚钳蝎对小菜蛾3~4龄幼虫及成虫的捕食功能反应属于Holling 功能反应模型Ⅱ型,对幼虫和成虫的瞬间攻击力分别为0.661和0.687,最大捕食量则分别为36.36头和125头。东亚钳蝎有较强的种内干扰作用,随着捕食者密度的增大,捕食作用率相应降低。猎物和天敌相互干扰会降低东亚钳蝎对3~4龄小菜蛾幼虫的寻找效应,但对其捕食量影响不大。在小菜蛾幼虫和成虫的混合种群中东亚钳蝎偏嗜小菜蛾成虫。     

陕西小菜蛾对9种杀虫剂的抗药性监测

【目的】明确陕西关中地区小菜蛾田间种群对9种常用杀虫剂的抗药性现状,为抗性治理和田间有效防治小菜蛾提供依据。【方法】在室内采用生物测定法和区分剂量法,测定2012-2013年间陕西杨凌、宝鸡和渭南3个地区小菜蛾田间种群对阿维菌素、高效氯氰菊酯、丁醚脲、啶虫隆、溴虫腈、茚虫威、多杀菌素、Bt毒素Cry1Ac和氯虫苯甲酰胺9种常用杀虫剂的敏感性。【结果】陕西3个地区的小菜蛾田间种群对大部分供试药剂都产生了不同程度的抗性。宝鸡、渭南和杨凌种群均对高效氯氰菊酯产生了高-极高水平抗性,对阿维菌素产生了中等-高水平抗性,对溴虫腈和啶虫隆产生了低-中等水平抗性,对茚虫威、多杀菌素和氯虫苯甲酰胺的抗性水平相对较低,处于敏感-低水平抗性。对丁醚脲和Bt毒素的抗性各地差异较大,对丁醚脲的抗性,杨凌种群处于低-中等水平抗性,渭南种群处于中等水平抗性,宝鸡种群处于敏感性下降;对Bt毒素的抗性,宝鸡种群处于中等水平抗性,杨凌和渭南种群处于敏感性下降-低水平抗性。【结论】3个地区应停止使用已产生高水平抗性的高效氯氰菊酯和阿维菌素,减少已产生中等水平抗性药剂的使用次数,处于低水平抗性的杀虫剂可作为防治小菜蛾的主要药剂。在杀虫剂使用过程中应注意药剂的轮换使用,以延缓小菜蛾抗药性加剧。     

重叠延伸PCR法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究

【目的】探索重叠延伸PCR法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸PCR法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。     

银中杨DREB基因的克隆及表达

【目的】克隆银中杨抗逆转录因子DREB基因,为其功能的深入研究奠定基础。【方法】根据DREB AP2/EREBP保守区设计1对简并引物,采用PCR方法对银中杨（Populus albaxp）转录因子DREB基因中间片段进行克隆;再利用反向PCR方法对该基因的旁侧序列进行克隆,最终将两侧序列与中间片段拼接得到基因全长;同时,根据基因序-列设计1对特异引物,利用荧光定量PCR分析银中杨DREB基因在不同逆境胁迫中的表达情况。【结果】成功地从银中杨中克隆到1个DREB基因,命名为PaDREB（注册号：EF582843）。该基因序列长935 bp,ORF为819 bp,编码272个氨基酸;同源性比较与系统发育分析证实,银中杨DREB属于DREB转录因子家族,并与月季DREB2C具有较高的同源性;荧光定量PCR检测结果显示,盐、低温、干旱及ABA均能诱导DREB基因的表达。【结论】首次从银中杨中分离并克隆了DREB基因,并证实其参与了银中杨对盐、低温、干旱及ABA的应答。     

雷公藤生物碱制品对小菜蛾和菜青虫的控制效果

测定了雷公藤总生物碱对小菜蛾和菜青虫的室内毒力,以及0.1%雷公藤生物碱乳油对两种害虫的田间防效。结果表明,雷公藤总生物碱对小菜蛾3龄幼虫48和72 h的LC50值分别为228.28和136.67 m g/L,对菜青虫5龄幼虫48和72 h的LC50值分别为307.61和238.18 m g/L;1.0%雷公藤生物碱乳油对小菜蛾的毒杀作用较强,其48和72 h的LC50值分别为69.62和20.35 m g/L,对菜青虫48和72 h的LC50值分别为93.18和44.62 m g/L。250倍稀释的雷公藤生物碱乳油(有效含量为40 m g/L)田间喷雾处理对小菜蛾和菜青虫均具有较好的防治效果,施药后7 d的防治效果分别为82.93%和82.71%,在本试验剂量范围内对作物安全。可见,雷公藤生物碱制品对两种蔬菜害虫控制效果显著。     

蚕豆耐盐相关基因VfHKT1;1的克隆、生物信息学分析及表达特性

高亲和性钾离子转运蛋白(high affinity K+transporter,HKT)能够调节细胞及整株的Na+/K+转运,在植物盐胁迫调控中发挥着重要作用.采用RT-PCR和PCR方法克隆获得蚕豆VfHKT1;1基因全长编码序列,该基因包含1659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸.系统进化树分析发现,该蛋白属...     

3种绿色防控技术对小菜蛾的防治效果

小菜蛾（Plutella xylostella）是危害十字花科植物的重要害虫之一,防治方法主要是应用化学农药防治,使得农药残留、抗药性及再猖獗问题日益严重。为明确不同绿色防治技术对小菜蛾的防治效果,采用田间试验方法,在甘蓝田进行不同类型的诱捕器和诱芯比较、7种生物农药筛选及释放螟黄赤眼蜂防治小菜蛾的3种绿色防控技术试验。结果表明：不同诱捕器和诱芯诱蛾效果差异显著,天然橡胶塞诱芯诱蛾效果明显优于毛细管型诱芯,船型诱捕器配绿色天然橡胶塞型诱芯或红色塑料毛细管型诱芯为最佳组合。生物药剂中乙基多杀菌素防治小菜蛾的速效性最好,药后1 d防效达到78.93%;小菜蛾颗粒体病毒在药后7 d防效达到最高,达到86.68%,但持效性较短。田间释放螟黄赤眼蜂对小菜蛾卵寄生率均达到65%以上,对小菜蛾卵的寄生效果良好。这3种技术对小菜蛾的绿色防控具有一定的指导和参考价值,可在田间示范和推广。