转基因抗虫耐除草剂(Cry1Ac+EPSPS)玉米对草甘膦耐受性研究

将具有我国自主知识产权的抗虫、耐除草剂基因转化到玉米中获得兼具抗虫和耐除草剂的复合性状转基因玉米,实现了玉米复杂性状的有效改良,研究了转耐除草剂CC-2基因和可表达Bt毒素的cry1Ac基因的双抗玉米对除草剂的耐受性及目标蛋白表达量。通过调查喷施除草剂后玉米植株存活率及株高和生长发育情况,研究了转抗虫耐除草剂基因玉米‘CC-2×BT799’、抗虫玉米‘BT799’、耐除草剂玉米‘CC-2’,以及常规玉米‘郑58’在田间对除草剂的耐受性,并用ELISA测定了供试品种中CP4EPSPS和Cry1Ac蛋白含量。对草甘膦的耐受性试验表明,转复合基因玉米‘CC-2×BT799’与单抗草甘膦品种‘CC-2’对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐施用剂量中量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。ELISA检测显示,CP4EPSPS蛋白在雄穗中的表达量较叶片稍高。且双抗品种‘CC-2×BT799’较‘CC-2’中的CP4EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量与‘CC-2×BT799’相当。在叶片中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量约为‘CC-2×BT799’的2倍。抗虫耐除草剂玉米能够有效抵御草甘膦的喷施,Cry1Ac蛋白含量在不同品种不同组织中存在差异。     

转cry1Ac玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

目标性状的有效性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价研究的重要内容之一。采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、室内生测和田间人工接虫鉴定研究了转cry1Ac玉米纯合群体BT-X和分离群体BT-38、BT-181、BT-43、BT-105等转化事件Cry1Ac蛋白的表达量以及对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）的室内杀虫和田间抗虫效果。转cry1Ac玉米鲜组织中Cry1Ac蛋白含量在44.07～438.00 ng/g之间,不同转化事件及不同组织之间差异显著,其中BT-X鲜花丝中Bt蛋白表达量显著低于未展开心叶。室内生测试验中除BT-43与对照没有显著差异外,取食其它转基因玉米心叶的亚洲玉米螟初孵幼虫6或7天的存活率为0～15.3%,显著低于非转基因对照;取食夏播BT-X鲜花丝6天的幼虫存活率为62.5%,显著低于Bt11及非转基因对照。田间心叶期接虫鉴定显示BT-X高抗亚洲玉米螟。说明转cry1Ac玉米BT-X、BT-181、BT-38和BT-105对亚洲玉米螟有很高的杀虫作用,BT-X田间抗虫效果良好。     

转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟的抗性评价

为探讨转cry1Ab/cry2Aj玉米对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)的抗性,采用室内生测和田间人工接虫鉴定方法评价了6个转cry1Ab/cry2Aj玉米品系对亚洲玉米螟的杀虫效果,并利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了Cry1Ab蛋白在各品系主要组织的表达水平.结果显示,亚洲玉米螟幼虫取食转基因玉米各品系雄穗、苞叶、花丝和雌穗48 h后死亡率在90％左右,取食心叶的死亡率在70％左右,96h后大部分幼虫死亡,而取食非转基因玉米的死亡率为3.3％～8.7％;春播和夏播田转基因玉米叶片、茎秆、雌穗基本没有被害,而对照玉米叶片、茎秆、雌穗被害严重,春播和夏播玉米平均每株分别有2.9、2.3头幼虫和蛹,2.8、3.4个蛀孔,隧道长度为7.5、14.2 cm,雌穗被害级别为5.3和5.1;6个转基因玉米品系中Cry1Ab蛋白在心叶、雄穗、花丝、苞叶和雌穗中稳定表达.综合评价认为,转基因玉米各品系在整个生育期内对亚洲玉米螟有很好的抗性,其中N50品系抗虫效果最佳,可以作为抗虫转多基因玉米育种的备选材料.     

转Bt基因玉米(瑞丰125、 DBN9936、 DBN9978)对亚洲玉米螟的抗虫效果研究

评价转Bt基因玉米对靶标生物亚洲玉米螟的杀虫作用是转基因玉米研发的重要一环.本文采用室内生测法对3种转Bt基因抗虫玉米'瑞丰125'(表达Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白),'DBN9936'DBN9978'(表达Cry1Ab杀虫蛋白)对亚洲玉米螟敏感品系ACB-S及抗Cry1Ab品系ACB-AbR、抗Cry1Ac...     

转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因抗虫耐除草剂玉米的田间抗性评价

为明确转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因的抗虫耐除草剂玉米的抗虫性和对除草剂的耐受性,本文通过田间人工接虫,以食叶级别、存活幼虫数、蛀孔数、隧道长度和雌穗被害级别等分别作为评价玉米心叶期和穗期的抗虫性标准,评价了转聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’及同型非转基因‘ND6708’、‘ND6515’和当地‘郑单958’品种对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫的抗虫效果;通过喷施除草剂后调查玉米植株的存活率,评价上述品种对除草剂的耐受性。田间试验结果表明:‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’两个转基因玉米品种对亚洲玉米螟、黏虫及棉铃虫的抗性水平均为高抗,且在4叶期和8叶期喷施草甘膦后其受害率均为0,而同型对照品种和当地对照品种喷施同剂量草甘膦后受害率为100%。综上,聚合cry1A.105、cry2Ab2和cp4epsps基因,具有抗虫耐除草剂复合性状的玉米品种‘ND6708YGRR’和‘ND6515YGRR’对亚洲玉米螟、黏虫和棉铃虫具有较强的抗虫效果,对草甘膦具有较好的耐受性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米为主要手段的综合防治技术体系提供依据。     

抗虫转基因玉米荒地生存竞争力评价

研究了转Cry1Ac基因玉米及受体非转基因玉米（郑58）在野外自然条件及模拟野外条件下的生存能力,比较玉米与杂草的竞争力及玉米自身成为杂草的可能性,为转抗虫基因玉米的环境生态安全评价提供理论基础。结果表明,生存竞争能力非转基因玉米〈转基因玉米〈杂草,转抗虫玉米虽然在与杂草的竞争中优于非转基因受体,其种子也能越冬,但在试验条件下不会演变成超级杂草。     

转cry1Ac基因抗虫棉对土壤三种酶活性的影响

为了明确转cry1Ac基因抗虫棉对土壤酶活性的影响,本研究采集转cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉‘SM 3’种植地的土壤,测定转cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉 ‘SM 3’不同生育期内根区距主根不同距离土壤脱氢酶、脲酶和磷酸酶活性的变化。结果表明,棉花根区土壤脱氢酶活性在整个生育期呈现出先升高后降低再升高的变化趋势,土壤脲酶和磷酸酶活性在整个生育期无明显的起伏变化。转基因棉‘GK 12’盛花期和枯死期根区5 cm的土壤脱氢酶活性显著高于亲本棉‘SM 3’（p<0.05）,转基因棉‘GK 12’盛花期根区15 cm和25 cm的土壤脱氢酶活性也显著高于亲本棉‘SM 3’（p<0.05）;在棉花蕾期,转基因棉‘GK 12’根区5 cm和15 cm的土壤磷酸酶活性显著高于亲本棉‘SM 3’（p<0.05）,而对根区25 cm的土壤磷酸酶活性无显著影响（p>0.05）;转基因棉‘GK 12’在整个生育期对不同距离土壤脲酶活性无显著影响（p>0.05）。上述结果初步看出,在棉花生长的一些生育时期,转cry1Ac基因抗虫棉‘GK 12’对根区土壤酶活性存在明显的影响,但其影响的程度不是很大,后期基本可得到恢复。     

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫的控制效果及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾生长发育的影响

为评估转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性及对非靶标害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾S.litura生长发育的影响,采用室内生测法测定其对棉铃虫的抗性及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同龄期幼虫存活率、营养代谢及中肠酶活性的影响。结果表明,转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫第2代幼虫的抗性程度最高,幼虫校正死亡率达91.33%,但对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性程度较低,幼虫校正死亡率分别为15.33%和13.33%。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾各龄期幼虫取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,其存活率与取食常规棉花对照无显著差异;甜菜夜蛾对转Cry1Ac/1Ab基因棉花叶片的相对取食量、近似消化率分别为16.68和93.12%,均高于取食常规棉花对照的10.72和92.00%,但差异不显著,而斜纹夜蛾取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后的各项营养指标均低于取食常规棉花对照,差异也不显著。取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,甜菜夜蛾的过氧化物酶活性为0.02 U/mg prot,显著低于取食常规棉花的0.05 U/mg prot;斜纹夜蛾的酸性磷酸酶活性为0.15 U/mg prot,高于取食常规棉花的0.10 U/mg prot,但差异不显著,其它中肠酶活性均低于对照,亦无显著差异。     

转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响

腰带长体茧蜂（Macrocentrus cingulum）是亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）幼虫的主要寄生蜂,对亚洲玉米螟种群具有重要的控制作用。玉米花粉可以作为腰带长体茧蜂的补充营养。本研究利用转cry1F基因抗虫玉米花粉作为补充食物饲喂腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟幼虫,研究其对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响,为转基因抗虫玉米的环境安全评价提供科学依据。结果表明,饲喂转cry1F基因抗虫玉米花粉后腰带长体茧蜂的寄生率、茧块重量、每茧块茧数、羽化率与饲喂对照玉米花粉相比无显著差异;在蜂蜜水+ Bt玉米花粉处理中虽然与对照玉米花粉处理相比雌蜂的寿命并没有显著差异,但雄蜂的寿命差异显著;在取食转cry1F基因抗虫玉米花粉的腰带长体茧蜂体内未检测到Bt蛋白成分。说明转cry1F基因抗虫玉米花粉对腰带长体茧蜂的存活和繁殖没有显著影响。     

转cry2Ah-vp基因玉米的抗虫性鉴定

为获得新型抗虫转基因玉米,将通过群体筛选获得的具有抗虫性的转cry2Ah-vp基因玉米VP1-5采用PCR、Southern blot、实时荧光定量PCR(qPCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)等方法进行阳性植株鉴定、拷贝数分析、转录水平和翻译水平分析,同时通过室内和田间生物活性测定鉴定转基因玉米VP1-5对东方黏虫Mythimna separata和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的抗性。结果表明,在转基因玉米VP1-5中cry2Ah-vp基因已整合到玉米基因组,以单拷贝的形式插入;cry2Ah-vp基因在转基因玉米VP1-5不同部位组织中均可以正常转录,在灌浆期叶片中的mRNA表达量最高,相对表达量为32.67,在灌浆期穗轴中的mRNA表达量最低,相对表达量为3.74;Cry2Ah-vp蛋白在转基因玉米VP1-5的6叶期各组织中表达量均较高,其中在叶片中的表达量达到2 155.18 ng/g FW,在抽雄期花丝中的表达量最高,达到2 165.86 ng/g FW;且转基因玉米VP1-5对东方黏虫有很高的杀虫活性,接虫3 d后幼虫死亡率达到100.00%;对亚洲玉米螟幼虫也有明显的生长抑制作用。表明转基因玉米VP1-5可作为玉米抗虫育种和害虫防治的种质资源。     

苏云金芽孢杆菌cry基因在大肠杆菌中表达产物和生物活性

研究了几种Bt cry基因于大肠杆菌(Escherichia coli)中表达产物在pH 10.0的50mmol/L碳酸钠和20mmol/L乙醇胺溶解液中的溶解性 ,发现同样的Cry蛋白在碳酸钠中的溶解度大于乙醇胺。通过胰蛋白酶消化 ,明确Cry1Ca7、Cry1Ia8酶解产物为 38kD多肽 ;Cry1Ie1、Cry1Cb2、Cry2Ab4酶解产物为 41kD多肽 ;Cry1Ac酶解产物为60kD多肽。采用FPLC层析方法对 6种原毒素及其酶解后得到的毒素多肽进行了分离纯化 ,比较了原毒素和毒素的杀虫活性的差异。其结果表明 ,Cry1Ac的原毒素和毒素对棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率均为 100% ,Cry2Ab4的原毒素的毒力高于其酶解毒素。     

Cry1Ac杀虫蛋白对甜菜夜蛾飞行能力的影响

转Bt基因作物上害虫取食Bt杀虫蛋白后存活并羽化的成虫飞行能力对于其飞离Bt作物,寻找庇护所中敏感个体进行交配、产卵,从而稀释抗性基因频率,实现“高剂量/庇护所”抗性治理策略具有重要意义。本文对取食含不同浓度Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料的初羽化（未取食补充营养）甜菜夜蛾飞行能力进行了测试,结果表明,幼虫取食含25、50、100 μg/g和200 μg/g Cry1Ac杀虫蛋白人工饲料存活并羽化的成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均差异显著（p<0.05）。取食含较低浓度Cry1Ac杀虫蛋白（25 μg/g和50 μg/g）的人工饲料有促进成虫飞行的倾向,尽管与取食不含Cry1Ac杀虫蛋白的对照相比,成虫飞行距离、飞行速度和飞行时间均未达到显著增加的水平,但强飞行个体比例明显增加。随着饲料中Cry1Ac杀虫蛋白浓度的升高,羽化的成虫飞行能力显著下降。雄蛾飞行能力下降的程度比雌蛾更加明显。这些数据为转Bt基因作物上迁飞性害虫的种群动态规律及其潜在的抗性治理策略提供了科学依据。     

不同Bt杀虫蛋白通过食物链对大草蛉的影响

为了明确目前转基因抗虫植物中表达的Bt蛋白对农田重要捕食性天敌大草蛉的生态安全性,采用三级营养食物链评价体系,分别以对供试Bt蛋白Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab具有抗性的靶标害虫或不敏感的非靶标害虫作为大草蛉的猎物,研究了供试3种蛋白对大草蛉的影响。结果表明,当大草蛉以抗性棉铃虫（抗Cry1Ac或Cry2Ab）或抗性玉米螟（抗Cry1F）为猎物时,供试3种Bt蛋白通过食物链对大草蛉幼虫（4龄幼虫重量和幼虫发育至蛹历期）、蛹（化蛹率、蛹重和蛹发育历期）及成虫（羽化率、雌虫重量、雄虫重量和单雌产卵量）的生长发育及产卵量均无显著影响;同样地,当大草蛉以对3种Bt蛋白不敏感的非靶标昆虫——绿盲蝽作为猎物时,通过食物链传递的Bt蛋白对大草蛉生长发育及繁殖也无显著影响。因此,目前转基因棉花、玉米或水稻中广泛表达的Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab蛋白,通过三级营养食物链,对大草蛉生长发育及繁殖均无潜在毒性。     

中黑盲蝽对四季豆豆荚和棉铃虫卵的取食选择性

盲蝽类害虫具有杂食性特点,但已有的取食行为研究主要集中于植食性,缺乏对其食性的全面认识。本文观察了中黑盲蝽在有选择和无选择条件下对四季豆豆荚和棉铃虫卵的取食与选择行为,并利用刺探电位技术分析了其对四季豆豆荚和棉铃虫卵的刺吸行为。研究显示:3种处理上中黑盲蝽总取食时间比例分别为:混合食物(四季豆豆荚和棉铃虫卵)38%、四季豆豆荚33%、棉铃虫卵27%,混合食物上取食四季豆豆荚的时间比例(22%)高于棉铃虫卵(16%)。6h测试时间内,中黑盲蝽刺吸四季豆豆荚时间为6 595s,高于棉铃虫卵(3 641s);单次刺吸时间以在四季豆豆荚上较高(334s)。以上结果表明中黑盲蝽喜欢取食混合食物,且倾向取食刺吸植物。研究结果对进一步解析中黑盲蝽的杂食性,探明其在生态系统中的地位及开发人工饲料有重要科学意义。     

美国白蛾hcapn3基因的克隆及HcAPN3蛋白与Cry1Ac结合特性分析

通过比对分析已知昆虫氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)氨基酸序列并结合本实验室的美国白蛾(Hyphantria cunea)中肠iTRAQ结果,设计了hcapn3基因特异引物,获得hcapn3基因片段。通过RACE-PCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因(hcapn3)全长序列(GenBank登录号为KJ013598)。Blastp分析表明,获得的氨肽酶属于氨肽酶N3家族,命名为HcAPN3。序列分析显示HcAPN3包括952个氨基酸残基,具有典型的谷氨酸锌化氨肽酶(Gluzincin)结构域和羧基端(ERAP1_C)结构域。利用Bac to Bac表达系统在昆虫细胞中表达108kDa的HcAPN3蛋白。在原核表达系统中表达58kDa的Gluzincin结构域和49kDa ERAP1_C的结构域蛋白。Ligand Blot分析结果显示,HcAPN3蛋白及Gluzincin结构域可与Cry1Ac蛋白特异性结合,但ERAP1_C结构域未能与Cry1Ac结合。本研究首次克隆了美国白蛾氨肽酶基因并分析了HcAPN3与Cry1Ac的结合特性,为下一步功能研究提供基础。     

Field-evolved resistance to Bt toxin Cry1Ac in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella (Saunders) (Lepidoptera: Gelechiidae), from India

BACKGROUND: The pink bollworm is one of the most destructive pests of cotton. Transgenic cotton producing Bt toxin Cry1Ac or a combination of Cry1Ac and Cry2Ab2 has been used effectively against this pest. However, some other insects have evolved resistance to Bt toxins in the field. During the 2007–2008 and 2008–2009 seasons, pink bollworm populations in India were surveyed to evaluate their responses to Cry1Ac and seed powder containing Cry1Ac and Cry2Ab2. RESULTS: The results provide evidence that resistance to Cry1Ac had evolved by 2008 in a population sampled from non‐Bt cotton in the Amreli district of Gujarat in western India. The median lethal concentration of Cry1Ac for five‐day‐old larvae (LC₅₀) was significantly higher for insects derived in 2008 from Amreli than for any of the other field populations tested from four locations in India. For Cry1Ac, the mean LC₅₀ for the strain derived from Amreli in 2008 was 44 times higher than for the most susceptible population. However, for seed powder of Bollgard II containing primarily Cry2Ab2, the 2008 Amreli population was only slightly less susceptible than the most susceptible population. CONCLUSIONS: The data reported here constitute the first evidence of field‐evolved resistance of pink bollworm to Cry1Ac. This initial evidence spurred more extensive evaluations during the 2009–2010 growing season, which confirmed field‐evolved resistance to Cry1Ac in Amreli. The lack of cross‐resistance to Cry2Ab2 suggests that plants producing this toxin are likely to be more effective against resistant populations than plants producing only Cry1Ac. Copyright © 2011 Society of Chemical Industry     

Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对大草蛉生长发育及酶活力的影响

为明确转Cry1Ac和Cry2Ab基因棉花对大草蛉的影响,运用Bt蛋白与人工饲料混合的方法,以大于转基因棉花叶片中蛋白含量20倍的剂量饲喂大草蛉初孵幼虫,初步研究了Cry1Ac和Cry2Ab对大草蛉生物学参数和消化酶、解毒酶活性的影响。结果表明：取食含Bt蛋白饲料的大草蛉幼虫的发育历期、体重、蛹重、成虫体重、羽化率等生物学参数与对照相比均没有显著差异;在大草蛉幼虫体内可以检测到含量较高的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白,分别为974.92~1 282.39 ng/g鲜重和5 592.62~6 082.92 ng/g鲜重,而在大草蛉成虫体内检测到的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白含量非常低,分别为0.29~0.39 ng/g鲜重和50.34~56.71 ng/g鲜重;取食含Bt蛋白的饲料对大草蛉幼虫的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶、氨肽酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性有一定的影响,但对大草蛉成虫影响与对照差异不显著。表明大草蛉取食含Bt蛋白的人工饲料后,虽然体内可以检测到一定含量的Bt蛋白,但对大草蛉的生长发育并没有显著的直接不利影响。     

四种Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫毒力测定及中肠组织病理学变化

为更好地了解苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis毒素蛋白对二点委夜蛾Athetis lepigone的毒力以及作用机理,通过饲喂含有Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab和Vip3Aa四种不同Bt毒素蛋白饲料,测定Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的毒力,并观察取食4种毒素蛋白后幼虫中肠组织的病理学变化。结果显示,二点委夜蛾幼虫取食毒素蛋白后72 h,Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性较高,校正死亡率为84.7%和76.4%;Vip3Aa和Cry2Ab毒素蛋白的毒力较弱。二点委夜蛾幼虫取食4种Bt毒素蛋白后,中肠柱状细胞微绒毛脱落,杂乱地分散在肠腔内,杯状细胞变形和腔内微绒毛脱落,线粒体和内质网等变形破裂,细胞核的核膜消失、核质凝聚和形状发生变化,经Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白处理后中肠细胞的病变症状和速度明显高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白处理。表明Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫杀虫活性较高,显著高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白,且对其中肠细胞的破坏作用也较强。