根癌农杆菌介导的抱子甘蓝转基因技术初探

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A. rhizogenes)介导的转基因技术已广泛地应用于十字花科芸薹属(Brassica)蔬菜。然而，在抱子甘蓝上仅有发根农杆菌的报道，且转基因频率很低〔1，2〕，尚未见到根癌农杆菌转化的报道。本试验试图探讨根癌农杆菌介导的转基因技术在抱子甘蓝上应用的可行性，为今后导入外源基因奠定基础。1 材料与方法试验在阿德雷德大学园艺系组织培养实验室进行，所用品种Roger和Troika为当地的优良品种。实验所用的外植体为幼苗的下胚轴，均通过以下方法获得：种子消毒后置于含1/2MS培…     

草莓果实外源基因瞬时表达系统的建立

将东北红豆杉紫杉烷13α-羟基化酶(Taxane13α-hydroxylase,13OH)基因全长cDNA正向插入到pCAMBI-A1304,构建其植物表达载体pCT13OH;将水稻小RNA169d(microRNA169d,miRNA169d)基因前体(precursor)全长DNA正向插入到pCAMBIA1305.1,构建其植物表达载体pCO169d。用电击法把它们导入根癌农杆菌GV3101,获得有关工程菌株。用1mL无菌注射器分别将这2种工程农杆菌悬浮液注射到草莓(Fragaria×ananassa)授粉后1周、2周、3周的果实中,发现授粉后2周果实适宜注射,可用于瞬时表达。对授粉后2周的果实进行不同注射部位、根癌农杆菌不同活化时期和根癌农杆菌悬浮液不同注射量试验,以蒂部注射、根癌农杆菌活化12h和0.5mL悬浮液注射量的效果最好,与结构基因13OH和调节基因miRNA169d相融合的GUS基因都得到表达,瞬时表达成功。     

罗汉果叶盘法感染农杆菌试验

罗汉果叶盘法感染农杆菌试验福建农业大学园艺系林顺权，陈振光以根癌农杆菌介导的外源基因转移技术已在一些农作物的基因工程研究上得到应用并取得了成功，在果树中，也已获得了苹果、核桃、李、桃、葡萄和草莓的转化植株。近年来，人们对具Ｒｉ质粒的发根农杆菌感染转化...     

沙田柚遗传转化的探讨

采用含ｎｏｓ基因和人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因ＡＰ－Ｄ基因的根癌农杆菌对沙田柚外植体进行转基因研究,与根癌农杆菌共培养产生的芽,苗经Ｋｍ敏感性筛选,获得了若干转基因植株,并对这些植株进行了报告基因ｎｏｓ表达的电泳检测,同位素标记、ＡＰ－Ｄ基因为探针的点印迹杂交,外源ＡＰ－Ｄ基因的ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交。结果显示,报告基因ｎｏｓ、抗菌肽Ｄ基因已转入沙田柚植株细胞中。     

抗病基因VpPR10转化‘砀山酥梨’及转化条件的优化

将源自中国野生华东葡萄的抗病基因——病程相关蛋白基因导入‘砀山酥梨’,并对转化系统条件进行优化。首先将VpPR10基因重组于中间表达载体pWR-Ⅱ,得到重组质粒pWR-Ⅱ-VpPR10;继而以改进冻融法将其导入根癌农杆菌EHA105,再利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法进行遗传转化。根癌农杆菌浓度OD600=0.5,离体叶片侵染5min,在含有100μmol·L-1乙酰丁香酮的培养基中暗处共培养48h有利于砀山酥梨的遗传转化;经PCR分析、Southern blot和RT-PCR检测,证明目的基因VpPR10已导入并整合到砀山酥梨基因组中;转化率为1.08%。     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

 通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。     

根癌农杆菌介导的桃幼胚转化实验参数研究

以桃幼胚作为根癌农杆菌介导转化的受体,通过对GUS基因瞬时表达率的分析,研究此转化体系的最佳实验参数。实验结果表明,预培养时间、感染时间、共培养时间和根癌农杆菌诱导物AS等对转化效率都有一定的影响。预培养1d、感染15min、共培养42h和不添加AS时GUS瞬时表达率最高。     

根癌农杆菌介导马齿苋愈伤组织遗传转化研究

利用马齿苋的叶片诱导出愈伤组织,再以愈伤组织为受体建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系得到抗性愈伤组织后,对其进行GUS组织化学染色和PCR扩增鉴定,证实为转化子,表明根癌农杆菌介导外源基因转化马齿苋的愈伤组织是完全可行的,为今后通过基因工程手段进行马齿苋的改良奠定了基础。     

含ipt基因生长素调控基因根癌农杆菌转化牵牛萌动种胚同工酶分析

以牵牛萌动种胚为受体,用含有３５Ｓ启动子－Ｇｕｓ基因－ｉｐｔ基因－Ｎｏｓ基因的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４３及含有３５Ｓ启动子－Ｇｕｓ基因－生长素调控基因－Ｎｏｓ基因的根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４进行转化。通过对转化及对照植株苗期叶的同工酶分析,发现转化植株叶的过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶谱带来对照植株有明显差异。转化频率较高。间接验证了外源ＤＮＡ的导入,说明同工酶分析方法可做为转基因植株早期筛选的方法之     

TuMV-Nib反义基因对大白菜的遗传转化研究

 以‘福山包头’大白菜子叶为试材, 以Anti2TuMV2Nib为目的基因, 利用根癌农杆菌介导法,建立了大白菜再生转化体系, 获得转化植株。经PCR-Southern杂交、RT-PCR 及ELISA 检测, 证明外源TuMV-Nib基因已整合到大白菜核基因组中并获得了表达。     

不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌遗传转化效率的影响

研究报道了不同根癌农杆菌菌株类型对木霉菌遗传转化效率的影响,结果表明,在所选用的3种根癌农杆菌中,AGL-1和GV3101介导的木霉菌转化获得成功,转化效率分别为60～180个转化子/107个孢子和40～120个转化子/107个孢子,而农杆菌LBA4404介导的转化没有获得成功.该研究为探讨根癌农杆菌介导的转化系统在其它丝状真菌遗传转化上的应用提供了参考.     

根癌农杆菌介导IFS基因对岷山红三叶遗传转化研究

以岷山红三叶草为试材,以其子叶和叶柄的愈伤组织为受体,采用根癌农村菌介导法,研究其遗传转化的条件,以期建立根癌农杆菌介导的异黄酮合酶IFS基因遗传转化体系。结果表明:利用该转化体系,获得的抗性愈伤组织,通过提取其基因组进行PCR扩增鉴定,证实为转化子。提示根癌农杆菌介导转化岷山红三叶愈伤组织是完全可行的,为利用基因工程方法改良红三叶的品种并获得高产异黄酮品系奠定了基础。     

梨韧皮部特异表达启动子AtSUC2驱动下的GUS基因的转化和表达

 以 ‘Old Home’ 梨无菌苗叶片为外植体, 利用根癌农杆菌介导将专一在韧皮部表达启动子AtSUC2 驱动下的GUS 基因转入 ‘Old Home’中。筛选出了‘Old Home’ 梨叶片高效遗传转化的最佳条件：农杆菌和外植体在液体培养基上共培比在固体培养基上共培转化率提高5倍。 PCR分析和Southern 杂交鉴定表明GUS 基因已整合到转基因植株的基因组中,组织化学检测和Western 杂交鉴定证明了GUS 基因在转基因植株韧皮部中的表达。     

农杆菌介导的几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转化辣椒研究

以苗龄7～10 d的辣椒组培苗为被侵染的外植体,通过农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因,研究基因型、外植体类型、抗生素浓度对辣椒遗传转化的影响,以期获得抗真菌病的转基因辣椒植株.结果表明:不同基因型间、外植体类型、抗生素种类和浓度对辣椒的遗传转化影响存在较大差异.以几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对辣椒进行了遗传转化,获得了3株抗性植株.     

橙色大白菜遗传转化体系的初步建立

以06J28橙色大白菜子叶段为外植体,通过根癌农杆菌介导CMS7311-orf224基因,探讨了潮霉素、头孢霉素、预培养时间、农杆菌浓度、感菌时间和共培养时间等因素对橙色大白菜遗传转化的影响.试验结果表明,子叶段预培养2~3 d后,在OD600值为0.3~0.5的农杆菌EHA-105菌液中侵染5 min,再共培养2~3 d,在培养基中加入5 mg/L Hyg (抗性筛选)和500 mg/L Cef(脱菌)可得到转化植株.试验初步建立了橙色大白菜遗传转化体系,为大白菜种质资源创新奠定了基础.     

野生型农杆菌Ti和Ri质粒对马铃薯的双转化研究

用不同的野生型根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T37，B6，TFA16YE和发根农杆菌（Agrobacteriu．rhizogenes）TR105，15834，A4对马铃薯普通栽培种品种“甘农薯1号”的块茎圆片、茎段采用两步侵染法和一步侵染法进行了双转化实验。结果表明：两步侵染法效果较好，并得到了分化苗。试验证明，Ti和Ri质粒上的T-DNA可进入同一个受体细胞并进行表达，2种T-DNA上的不同激素在受体细胞中表达可以使受体细胞建立新的激素平衡，从而提高了转化细胞分化苗的能力，可以克服野生型农杆菌难以分化苗的缺点，为今后用野生型质粒作载体以及同时向一个受体细胞中转移多个基因打下了基础；此外不同菌种组合的效果不同，分化植株的形态差异也很大；试验还发现，T-DNA在整合到受体细胞染色体上时，可以引起某些基因发生突变。因此，今后只要用双转化法能使野生型农杆菌双转化的细胞分化出正常植株，则野生型农杆菌就可以作为一种重要的诱变源为育种提供较多的变异。     

农杆菌介导的CBF基因转化哈密大枣

以哈密大枣无菌苗叶片为试材,以根癌农杆菌LBA4404为媒介将抗寒基因转录因子CBF基因导入哈密大枣,利用PCR、RT-PCR对转化植株进行鉴定,建立了哈密大枣的遗传转化体系。结果表明:在对哈密大枣无菌苗叶片进行遗传转化时,预培养2d,农杆菌菌液OD600为0.5,浸染20min,共培养3d的转化效率为最高。试验共获得7个抗性再生转化系。经PCR鉴定,CBF基因在7个抗性再生转化系中均为阳性;经RT-PCR分析,CBF基因在7个抗性再生转化系中均得到表达。     

基于In-fusion技术的ERECTA基因植物表达载体的构建

以黄瓜品种‘长春密刺’(CCMC)为试材,利用高保真酶Iproof及不依赖于酶切的In-fusion技术,构建基于本底启动子驱动的黄瓜ERECTA基因的植物表达载体,以探讨ERECTA基因在黄瓜中的功能,以期为黄瓜抗性性状的遗传改良提供技术支持。结果表明:从CCMC的基因组DNA中克隆的2段gERECTA(DNA序列)长度分别为8 940bp和9 812bp,并分别命名为CsgERECTA-Flag和CsgERECTA-Poly。经过质粒PCR、梯度片段PCR和测序结果的鉴定表明,pCAMBIA3301-gERECTA的2个植物表达载体都已成功构建并转入根癌农杆菌EHA105中。     

反义乙烯受体FaEtr2基因对草莓的转化

通过根癌农杆菌EHA105介导转化草莓叶片,在卡那霉素选择压下连续分化选择、扩繁和生根培养,获得了26株转乙烯受体FaEtr2反义基因植株。PCR和Southern blot检测证明,该基因已经整合草莓染色体中。Northern分析表明,转入的反义基因对靶基因都有部分的抑制。对果实乙烯释放量测定表明,转基因草莓中乙烯释放量降低。     

类胡萝卜素合成酶基因LycB导入番茄的研究

以4个番茄品种的子叶为受体,以LycB为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对番茄进行了遗传转化,经愈伤诱导、芽诱导、生根培养和潮霉素选择培养,获得的抗性植株经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因LycB已整合到番茄的基因组中。