赤桉FAD2基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

桉树是世界上重要的多功能树种,从桉叶中提取的桉叶油含有不饱和脂肪酸,对于桉叶油的药用活性和桉树的抗逆性具有重要的作用。为深入了解桉树的不饱和脂肪酸的生物合成途径和分子调控机理,本研究根据FAD2基因的保守区段设计兼并引物,从赤桉嫩叶中获得了一条FAD2基因的片段,并进一步利用RACE技术得到了此基因的全长cDNA,将其命名为EC-FAD2基因。通过生物信息学分析发现,该基因全长cDNA为1 472 bp,编码389个氨基酸,并且具有FAD2蛋白特有的保守序列和相关特征。经过比对分析,发现赤桉的FAD2蛋白与其他植物的FAD2蛋白具有较高的相似性。     

油茶ACP基因的全长cDNA克隆及序列分析

酰基载体蛋白是脂肪酸合成中的关键蛋白质,位于脂肪酸合成酶系的中央,作为脂酰基的载体将脂酰基从一个酶反应转移到另一个酶反应.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为基础,采用分子生物学技术分离克隆了油茶酰基载体蛋白基因全长cDNA序列.结果表明：油茶酰基载体蛋白基因的全长cDNA为669bp,包含1个完整的CDS及3′UTR和5′UTR,编码141个氨基酸,该基因被命名为co-acp并提交至GeneBank,登录号是EU717697;油茶酰基载体蛋白基因的推导氨基酸序列与其它15种植物的ACP进行AlignX比较的结果表明,油茶酰基载体蛋白与油橄榄ACP的相似性最高,而且遗传距离最近;预测油茶酰基载体蛋白的二级结构以α螺旋为主,没有跨膜结构域和信号肽,其等电点约为4.995.     

油茶FatB基因全长cDNA的分离克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE等技术,获得了油茶FatB基因的全长cDNA克隆。RACE测序结果表明:油茶FatB基因不是一个单基因,而是一个多基因家族;用生物信息学的方法预测各RACE片段的起始密码子和终止密码子的位置,在起始密码子上游和终止密码子下游分别设计RT—PCR引物,RT—PCR扩增结合随机测序、生物信息学分析,分离克隆出5个基因家族成员,分别命名为co—fatb1、co—fatb2、co—fatb3、co—fatb4、co—fatb5,其全长CDS为1 272、1 311、1 305、1 305、1 263 bp,将上述基因序列提交至GenBank,登录号分别为FJ899670、FJ899671、FJ899672、FJ899673、FJ899674;最后,对油茶FatB的氨基酸序列的特殊位点进行了标识和分析。     

猴头菌MnP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆猴头菌 CB1锰过氧化物酶( MnP)基因,用于分析 He-mnp1基因及蛋白序列、基因的结构与功能,为研究猴头菌 MnPs基因功能、转录调控和构建优良工程菌株提供参考。【方法】根据 GenBank 中已报道的白腐菌MnPs基因cDNA序列的保守区域设计引物,采用简并PCR、逆转录RT-PCR、cDNA末端的快速扩增( RACE)等方法扩增出全长 cDNA基因序列,命名为 He-mnp1( GenBank 登录号为 HM116841.3),并对其猴头菌 He-mnp1基因进行生物信息学的分析。通过 NCBI 数据库进行 BLAST 同源搜索; ORF Finder 查找该基因的完整开放阅读框( ORF);利用Expasy数据库和BioEdit软件预测He-mnp1蛋白质的理化特性及氨基酸的组成;同时进行亲/疏水性及跨膜区的分析;采用 SignalP 4.1软件进行蛋白信号肽的预测;并利用 Clustal W 和 MEGA 5.1软件对 He-mnp1蛋白序列同源性比对和构建白腐菌MnPs系统发育树;利用数据库Conserved Domain Database( CDD)蛋白保守结构域的预测,查看 He-mnp1血红素、基质及锰、钙等结合位点;采用 PredictProtein 软件和 SWISS-MODEL 软件进行He-mnp1蛋白二级结构的预测和同源三维建模。【结果】该基因 He-mnp1的 cDNA 全长1279 bp,完整开放阅读框1080 bp,起始密码子 ATG,终止密码子 TAA,5'端非翻译区有68个核苷酸,3'端非翻译区有131个核苷酸,编码蛋白359 aa;生物信息学分析表明,猴头菌 He-mnp1氨基酸组成中丙氨酸含量最高,无酪氨酸,分子量为38.18 kDa,等电点为4.35,He-mnp1的蛋白有明显的亲水区,存在81－105、121－141间有2处疏水区域,此蛋白为亲水蛋白。He-mnp1蛋白质多肽前体包含1个18 aa的信号肽及1个5 aa的中间前导短肽。【结论】蛋白系统进化分析表明He-mnp1分布在第2组群,与平菇侧耳、冬生多孔菌、变色栓菌的 MnPs亲缘关系最为接近。He-mnp1基因存在1个保守结构域,分析显示为 Class Ⅱ类的真菌血红素过氧化物酶蛋白家族。He-mnp1蛋白二级结构预测α－螺旋占30.99%,β－折叠占3.38%,无规则卷曲占65.63%,属于稳定蛋白。He-mnp1蛋白三维建模,结果得到1个 Fe 血红素,2个 Ca2+、1个 Mn2+的结合位点及组氨酸残基等。     

油茶丙酮酸激酶基因全长cDNA克隆及序列分析

丙酮酸激酶是糖酵解途径的关键酶,在油料作物脂肪酸合成中有重要作用。在实验室构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶PK基因的全长cDNA克隆。该基因序列长2 114 bp,开放读码框为1 737 bp,编码579个氨基酸,蛋白分子量为63 766.5 Da,分子式为C2774H4470N784O875S30,与其他植物的PK基因具有较高的相似性。PK基因系统进化树表明,油茶与蓖麻、杨树、葡萄的亲缘关系最近。     

1个油茶Y2SK2型脱水素的全长cDNA克隆及生理功能的预测

以构建的油茶EST文库为基础,采用电子克隆技术,分离克隆一个脱水素基因的全长cDNA序列,该基因的cDNA全长1 406 bp,含一个600 bp的CDS,编码200明的小分子蛋白.推测该基因编码蛋白的分子质量为21 ku,等电点7,暂命名为CoDHNI.同源性分析发现该基因的编码蛋白具有2个Y-片段(DEYGNP),1个S-片段(SGSSSSSS),2个K-片段(KIKEKLPG),属于典型的Y2sIQ型脱水素.经Blast比对,发现富含苏氨酸的Thr-区在各物种间变异显著,推测该区为油茶所特有,有利于在被保护的大分子表面形成水合层;同时还发现一个十分保守的基序:EDDGQGGRRKK,可能有利于脱水素的磷酸化和亚细胞定位.通过与柑桔和拟南芥的脱水素比较,提出CoDHNI有可能缓冲种子脱水胁迫响应时钙离子的瞬时增高,并可结合重金属离子,以减轻活性氧的危害.     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析

FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因.在构建的油茶.EST文库基础上,采用5'RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆.该基因序列长1 682 bp,开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2特有的保守序列和相关特征.经过比对分析,发现油茶的FAD2基因与其他植物的FAD2基因具有较高的相似性.     

油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE、交错PCR等技术,获得了油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长cDNA克隆。该基因cDNA序列全长1 901 bp,含有一个1 599 bp的ORF,编码533个氨基酸残基。BC蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58 509.3 u,含两个跨膜结构域,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中发现12个α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构。该基因已登录到GenBank,并被命名为co-bc。     

黑麦草抗冻蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

对多年生黑麦草进行冷胁迫处理后,提取叶片总RNA,采用RT-PCR法获得了LpAFP成熟蛋白的cDNA克隆。序列分析结果表明,该成熟蛋白的开放读码框(ORF)长度为357 bp,编码一条由118个氨基酸组成的多肽。生物信息学分析结果表明,黑麦草成熟抗冻蛋白与其他植物抗冻蛋白的同源性较低,与鱼类抗冻蛋白和昆虫抗冻蛋白则没有同源性。     

油茶种子cDNA文库构建中的问题与对策

以湘林1号和湘林．1号油茶优良无性系近成熟种子为材料．总结了构建油茶种子cDNA文库过程中存在的一些关键问题和应采取的对策．为今后油茶和其它油料植物种子的mRNA提取、构建高质量的cDNA文库及ESTs文库等提供技术参考和理论指导。     

油茶种子水通道蛋白CoPIP1-1的鉴定与分析

以构建的油茶cDNA文库为基础,采用交错延伸PCR技术,分离克隆到一个水通道蛋白基因的编码序列(coding sequence,CDS),它编码一个287aa的跨膜蛋白(GenBank蛋白质id:ACF39901)。该蛋白可能由2条基因(GenBank登录号:EU850810、EU850811)编码,这2个基因具有相同的CDS和3′-UTR,但5′-UTR不同,其中之一多了2个小的插入片段。经对该蛋白的同源性比对和特征性基序分析,推测这个水通道蛋白属于质膜内在蛋白成员,定名为CoPIP1-1。通过同源建模,论证CoPIP1-1的水通道活性与通道口的(去)覆盖有关。N端与D环、B环的静电势作用导致了对通道口的(去)覆盖,并受磷酸化/质子化门控机制调控,质子化抑制通道活性,磷酸化则解除抑制。从同源建模的结果和细胞内的氧化状态推测该蛋白为组成型的低活性,这可能是油茶种子近成熟期脱水的成因之一。     

油茶种子脂肪酸与游离氨基酸的分析

以4个油茶良种种籽为试材,采用索氏法提取油茶种子中的油脂,运用气相色谱分析测定油茶种子中的脂肪酸的相对含量,利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸的组成及含量。结果表明:不同良种间脂肪酸的相对含量差异显著,‘华硕、华金、华鑫、湘林XLC15’其不饱和脂肪酸相对含量高达89.15%;棕榈酸相对含量介于9.39%~13.18%;硬脂酸介于1.46%~2.86%。4个油茶种子中均含有17种游离氨基酸,其中总氨基酸含量最高者为‘华硕’是673.1 mg.100 g-1,次之为‘华鑫’是583.9 mg.100 g-1,最低为‘华金’是404.6 mg.100 g-1。不同良种间在精氨酸的含量差异显著,其他氨基酸差异不显著。     

油茶嫁接山茶花的技术

对山茶花品种嫁接技术进行了系统研究,结果表明:利用油茶(Camellia oleifera)树桩作砧木,经过砧木树桩的采集、移植、嫁接和嫁接后管理等过程,能较快地培育出较大型、树姿美观的茶梅(Camellia sasanqua)观赏树.油茶砧木树桩来源广,嫁接成本较低,经济效益较好.     

油茶研究文献的可视化分析

为了解油茶（Camellia oleifera）的研究近况,以 Web of Science 数据库截至2016年4月1日收录的所有关于油茶的文献为对象,利用 Histcite 和 SATI 等软件对其进行文献计量和可视化分析。结果表明,该数据库检索的222篇相关文献刊载于147种期刊中,每种刊物平均发表文章1.51篇;共有742位作者,20个国家或地区,196个研究机构参与。此外,论文发表数量呈逐年增加的趋势,主要发表在《Hortscience》、《Journal of Agricultural and Food Chemistry》等农林科学类杂志,中国是发文量最多的国家,占总发文量的84.23%,中南林业科技大学是发文最多的机构,发文量占总发文数量的18.1%,研究的热点主要集中在茶油抗氧化活性、皂素等方面。     

软枝油茶扦插育苗技术

2000年对软枝油茶扦插育苗进行了插床基质、促根激素、插条类型及留叶量等对比试验，结果表明：以带顶芽保留2片以上小叶的插条，用ABT6号生根粉溶液泡浸，扦插于90%黄心土加10%细沙的基质中，在大面积育苗生产应用中，插条生根率达93％，移苗成活率达98%。文内还系统总结了育苗技术措施。     

气相色谱法测定油茶籽中4种脂肪酸含量

采用气相色谱法测定油茶籽油中脂肪酸组成,结果表明：采用索氏提取法提取的油茶籽油主要由4种脂肪酸组成,分别为棕榈酸平均含量为8.44％、硬脂酸平均含量为1.46％、油酸平均含量为80.92％、亚油酸平均含量为8.26％.