植物afp表达载体的构建及其对农杆菌的直接转化

详细报道了胡萝卜抗冻蛋白基因（afp)植物表达载体的构建过程及其直接法转化农杆菌的方法，以限制性内切酶从克隆载体上切取afp基因，将其连接在相应酶切的pBI121工程质粒上，构建成afp植物表达载体，采用直接转化法将重组子导入根癌农杆菌，并用PCR方法进行了鉴定。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301,并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt(潮霉素磷酸转移酶基因),经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

蚯蚓纤溶酶基因番茄表达载体的构建

为研究蚯蚓纤溶酶的番茄表达,构建EFE基因的番茄表达载体pF和pEF,并导入农杆菌。采用PCR法在EFE基因DNA序列上添加了表达调控元件和酶切位点后,得到新EFE基因片段,将该片段与切去GUS基因的pBI121载体相连,以构建CaMV35S驱动的EFE组成型表达载体pF;用PCR克隆得到的E8启动子片段替换pF上的35S启动子,以构建番茄成熟果实特异性表达载体pEF;最后,采用三亲交配法用重组质粒转化根癌农杆菌EHA105;结果表明:经过酶切、PCR和测序鉴定,EFE基因、E8启动子序列已重组到表达载体上,植物表达载体构建正确,并且已经转化进农杆菌EHA105中。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

韧皮部特异性启动子的克隆及含绿色荧光蛋白报告基因新植物表达载体的构建

用PCR方法扩增得到了长度为966bp的笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子片段,克隆人pUCm—T载体后,获得了新的重组质粒pUCm—PSP．分别用限制性内切酶酶切重组质粒和pCAMBIA1302植物表达载体,经回收、连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的新型植物表达载体pHZ03．利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中．     

茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建

采用能有效转化双子叶植物的表达载体pBI121构建植物硒营养代谢关键酶基因的表达载体,将原载体中GUS基因用茶树ATP硫化酶基因(APS1和APS2)替换,将硒半胱氨酸甲基转移酶基因(CsSMT)连接到pBI121载体上直接与GUS基因相连,分别构建了目的基因植物表达载体pBI-APS1、pBI-APS2和pBI-CsSMT.通过三亲杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转化工程菌,为通过植物基因工程获得富硒农产品打下基础.     

PBI121/GPAT质粒的构建及对非洲菊转化*

 为提高植物抗寒性,本文构建一个植物表达载体,并对非洲菊进行转化。用已克隆的强抗冷植物兵豆的甘油-3-磷酸转酰酶（GPAT）基因构建表达载体,将GPAT插入表达载体pBI121质粒取代该质粒上原有的GUS基因,并用PCR和酶切进行鉴定。用农杆菌介导的方法将该质粒转化到非洲菊中。结果表明该植物表达载体构建成功,同时对非洲菊高效转化体系进行探索,获得卡那霉素抗性苗7苗。     

鲑鱼降钙素基因向烟草遗传转化的初步研究

报道了鲑鱼降钙素基因植物表达载体的构建及其向烟草的遗传转化.由鲑鱼降钙素的链霉菌表达载体pMS680,通过限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切后将其克隆至中间载体pART7,获得中间表达载体pART7-sCT,从而给目的基因加上启动子和终止子,将限制性内切酶Not1酶切pART7-sCT得到的带有启动子和终止子的目的基因片段克隆至载体pART27,得到鲑鱼降钙素基因的植物表达载体pART27-sCT.通过农杆菌介导的叶盘法将其转至烟草,经PCR检测已得到转基因植株.     

丝状真菌转化载体的改进

为了改进农杆菌介导丝状真菌遗传转化用的Ti双元载体,将质粒pUCATPH上真菌trpC基因启动子驱动的潮霉素B抗性基因(hygB)表达盒转移到Ti质粒pPZP111上,构建成用于丝状真菌遗传转化的Ti载体pATZ。将植物表达载体pDL916上的草丁膦抗性bar基因重组到载体pKS-trpC上,构建成含真菌启动子、终止子调控的bar基因表达盒的中间载体pTrpCBar;之后将该表达盒转移到pPZP111载体上,得到以bar基因为筛选标记的真菌转化Ti质粒pTBZ。上述质粒载体经酶切鉴定和DNA测序证实构建正确,为丝状真菌的农杆菌介导遗传转化提供了新的工具。     

胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建

以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 T4DNA连接酶的作用下进行定向连接 ,构建成胡萝卜 afp的植物表达载体 p BAF     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建

选育耐贮运品种是解决甜瓜贮运难题的有效途径之一.用特异引物从含甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)cDNA全序列的pCMPG质粒中克隆出PG基因,将该基因连接至pGEM-T Easy载体,获得重组质粒pGEM-PG.先用SacI和XbaI双酶切pGEM-PG,再用SacI和XbaI消化pBI121,得到除去了GUS基因的线状载体.从pGEM-PG质粒上切下的PG1 cDNA片段的粘性末端和pBI121线状载体的粘性末端恰好反向匹配,构建了甜瓜PG1 cDNA反义序列植物表达载体.     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建

目的：构建HBVX基因与pCI-neo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物,以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列,将X基因连接到真核表达载体pCI—neo上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

猪线粒体DNA D-loop PCR-RFLP分析

对太湖猪（二花脸）、大约克猪、北京黑猪、五指山猪、香猪、长白猪、杜洛克猪以及太湖猪与7个品种猪的正反交杂交家系线粒体DNAD－loopPCR－RFLP分析,发现猪的线粒体DNAD－loop约为1500bp,长白猪及部分大约克猪与其他猪品种在AccⅠ酶切位点存在多态性;太湖猪、大约克猪的正反交后代的线粒体DNAD－loop在AccⅠ酶切位点存在多态性,其遗传方式遵循母系遗传特性。     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物,以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材,扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切,不育系产生1条保持系中没有的特异片段,其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记,该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

SQR基因在大肠杆菌和乳酸菌中的表达

为了研究硫化物-醌氧化还原酶(SQR)基因的乳酸菌表达载体pMG36e-SQR-Myc的构建及其在大肠杆菌DH5a和乳酸菌MG1363中的表达,通过限制性内切酶酶切大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pMG36e与目的片段SQR-Myc,回收纯化并用T4连接酶进行连接,连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5a中,提取所得到阳性大肠杆菌菌株质粒pMG36e-SQR-Myc进行双酶切鉴定与普通PCR鉴定;并通过电转化将重组质粒导入乳酸菌MG1363中,采用SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测SQR蛋白质在其中的表达情况。结果显示,SQR乳酸菌重组表达载体pMG36e-SQR-Myc被成功构建,目的蛋白质SQR在大肠杆菌和乳酸菌MG1363中被成功检测到。因此,乳酸菌MG1363可以用来表达硫化物-醌氧化还原酶(SQR)。     

黄粉甲抗冻蛋白基因afp72 cDNA的克隆和序列分析

[目的]为抗冻蛋白基因afp72的体外表达和生物学功能研究奠定基础。[方法]从黄粉甲脂肪体中提取总RNA,通过RT-PCR克隆抗冻蛋白基因afp72,并构建克隆重组质粒pUCm-T-afp72。经双酶切后,将其与表达载体pMAL-p2X连接并转化到大肠杆菌TBI,构建表达重组质粒pMAL-p2X-afp72。[结果]afp72 cDNA长度为216 bpa;fp72的测序序列与GenBank中编码84个氨基酸的黄粉甲afps序列的同源性为89.48%a;fp72基因可能来自其他黄粉甲抗冻蛋白基因的突变或缺失;从蛋白水平上证实AFP72是一个抗冻蛋白,afp72是一个抗冻蛋白基因;表达重组质粒pMAL-p2X-afp72的构建是成功的。[结论]该研究为利用基因工程方法构建抗冻蛋白转基因植物提供了材料。     

FaDREB1基因RNAi的植物表达载体的构建

以pMD18-T-FaDREB1为基础,构建了由35s启动子调控的FaDREB1基因RNAi的植物表达载体pART27-FaDREB1(1)-FaDREB1(2),并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LB4404中。对于研究RNAi的机理和应用以及研究DREB类转录因子基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。