核盘菌和三叶草核盘菌的生态特性与致病性比较

在调查核盘菌和三叶草核盘菌发生为害的基础上，以核盘菌菌株Ｒａｐ－１和三叶草核盘菌菌株ＣＭＶ－２为代表，比较了温度及降雨等因子对菌丝生长及菌核萌发的影响。在１５￣２８℃下Ｒａｐ－１菌丝生长较ＣＭＶ－２快，但在８℃下则相反；Ｒａｐ－１菌核在自然条件下萌发期间的温度较ＣＭＶ－２菌核萌发时温度高，两者菌核萌发呈现出明显的先后秩序。春季降雨的波动导致２种核盘菌的菌核萌发出现波动。离体致病性测定结果表明，核盘     

盾壳霉寄生核盘菌过程中葡聚糖酶、几丁质酶及电导率的变化

为了解盾壳霉寄生核盘菌的生化机理,采用了紫外分光光度法测定了盾壳霉寄生菌核过程中,葡聚糖酶和几丁质酶的变化,并用电导率仪测定了这个过程中电导率的变化。结果表明:从被盾壳霉寄生的活菌核检测到(处理)葡聚糖酶和几丁质酶活性明显高于活菌核和被盾壳霉寄生的死菌核,其中处理的葡聚糖酶活性从15 d以后就明显高于菌核自身也高于盾壳霉本身的酶活性,处理的几丁质酶活性从10 d起就维持在较高水平,处理的电导率从10 d以后明显高于活菌核。在这个过程中这两种酶活性提高,电导率增大,膜透性增强。     

磷酸二酯酶通过cAMP-PKA途径调控核盘菌菌核原基的形成

在PDA培养基中添加不同浓度的磷酸二酯酶（PDEs）抑制剂阿托品,检测其对核盘菌生长发育的影响,并采用qRT-PCR方法检测PDEs主效基因及cAMP-PKA通路中相关基因的表达情况,研究核盘菌PDEs在cAMP-PKA通路中的作用,为开发以PDEs为靶标的新型杀菌剂提供理论基础。结果表明,当阿托品添加浓度为4 mmol/L时,核盘菌菌丝生长速率和菌核形成均受到影响。从核盘菌基因库中检索出了8个PDEs,qRT-PCR结果显示,PDE1/2在核盘菌菌核形成过程中表达量较高。添加PDEs抑制剂后,cAMP-PKA通路中PDEs上游基因AC和RAS表达量上调,但PDE1、PDE2和下游因子PKA表达量均下降。由此可知,PDEs在核盘菌菌核形成方面具重要作用,PDEs抑制剂通过抑制PDE1/2的表达使得下游因子PKA表达量下降,进一步影响菌核原基的形成。     

核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达

不含有内含子的核盘菌arom基因已经被扩增、测序. 该基因编码五功能的AROM蛋白. 为了大量获得核盘菌AROM蛋白的结构域之一5烯醇丙酮酰莽草酸-3磷酸合酶（EPSPS）,将该菌arom基因编码脱氢奎尼酸合酶（DHQS）和EPSPS两结构域的DNA序列和只编码EPSPS结构域的DNA序列分别克隆入载体pGEX-4t-2和载体pET28b中,构建了4个表达载体pGEX-DE、pGEX-E、pET-DE和pET-E, 并将其转入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21（DE3）或大肠杆菌JM109中表达. 酶活测定和SDS-PAGE分析结果显示,上述编码序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGEX-E、pET-DE和pET-E的大肠杆菌BL21（DE3）转化子具有EPSPS的催化活性,说明核盘菌arom基因的这些DNA片段可以被单独表达. 核盘菌EPSPS异源表达系统的 建立为该酶的抑制剂设计奠定了基础.      

向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核菌丝型萌发特性

为明确向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核的菌丝型萌发特性,采用控制变量法测定不同因素对菌核菌丝型萌发的影响.结果 表明,温度为5～30℃时菌核均能进行菌丝型萌发,最适温度为25℃,30℃时菌核菌丝型萌发后无法形成菌核;酸性条件利于菌核进行菌丝型萌发和菌核形成;光照时间越长越利于菌核菌丝...     

人参核盘菌菌核分泌液致病性及生物学特性研究

为明确人参核盘菌菌核分泌液致病性及其生物学特性,利用离体接种法比较人参核盘菌菌丝及其分泌液对人参根组织的侵染特性,运用3,5-二硝基水杨酸法测定人参核盘菌菌丝及其分泌液中细胞壁降解酶种类及活性差异,采用平板培养法分析了不同培养基、碳源、氮源和pH值对人参核盘菌菌丝生长、产核及分泌液形成的影响。结果表明:接种病菌分泌液和菌丝均能导致人参根部产生坏死状病斑,且接种分泌液的病斑出现时间早于接种菌丝,但分泌液持续侵染能力比菌丝弱。分泌液和菌丝中均含有PG酶和Cx酶,分泌液中的PG酶活性高于菌丝,Cx酶活性低于菌丝,PMG酶仅在菌丝中检测到,分泌液和菌丝中均不含β-葡萄糖苷酶。病菌在SDA培养基中生长速度最快,在V8培养基中菌核产生数量最多,在MEA培养基中菌核鲜重和干重最重,在PDA培养基中,供试菌株分泌液产生量最大。以蔗糖与葡萄糖为碳源时,供试菌株菌丝生长速率最快,以葡萄糖酸钠为碳源时,菌核产量最多,以果糖为碳源时,菌核鲜重和干重值最大,以葡萄糖为碳源时,菌核分泌液产生量最大。以蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉为氮源时,供试菌株菌丝生长速率最快,以酵母浸粉为氮源时,菌核产量、鲜重、干重和分泌液产生量...     

产几丁质酶内生放线菌的筛选及其对核盘菌的抑制作用

采用透明圈法对分离自9种植物的186株高产几丁质酶内生放线菌进行筛选,获得1株分离自黄精块茎的菌株GKSHJA,用液培法测定其对病原菌的抑制效果.结果表明:该菌株对油菜菌核病菌的抑制率为85.4%,该菌的粗酶液对其他10种常见植物病原菌菌丝生长具有不同程度的抑制效果;依据形态学特征、生理生化特性和细胞化学分析,该菌株被鉴定为黄色长孢链霉菌(Streptomyces longisporoflavus);对GKSHJA菌株产酶条件的研究结果表明,当碳源为1%的粉状几丁质,氮源为0.30%的牛肉膏,初始pH6,32℃培养6d时,培养液中几丁质酶活性较高.     

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质初步研究

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质研究表明:几丁质酶和葡聚糖酶的酶促反应,在本试验计量范围内,其反应速度与酶量和底物浓度均呈正相关,但两种酶促反应适宜的温度和pH值有较大差。几丁质酶降解几丁质的最适反应温度为50℃,最适pH值为8.0,葡聚糖酶降解葡聚糖的最适反应温度为60℃,最适pH值为3.0。     

毕赤酵母异源表达几丁质酶对大豆核盘菌的生防潜能分析

将来自于棘孢木霉的几丁质酶基因整合到了毕赤酵母基因组中,并对表达产物进行了生防潜能分析。结果表明,p H值为6和温度为40℃时几丁质酶活性最高,表达产物能够显著抑制大豆核盘菌的生长,并通过诱导ROS积累和抗性酶活性提高大豆对核盘菌的抗性。     

内生细菌EDR2的鉴定及其对油菜菌核病的防治

【目的】明确内生细菌EDR2菌株的分类地位以及对油菜菌核病的防治作用,为该菌株的进一步应用奠定基础。【方法】采用皿内和温室盆栽试验,测定菌株EDR2对油菜菌核病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用以及对病害的防治效果;并结合菌体形态观察、生理生化特性测定以及16SrDNA序列分析确定该菌株的分类地位。【结果】内生细菌EDR2菌株能够有效抑制油菜菌核病菌的菌丝生长,并可导致菌丝出现畸形、细胞质外渗,同时其还对病菌的菌核萌发具有较强的抑制作用,培养原液的抑制率可达到96.6%。温室盆栽试验结果表明,菌株EDR2的培养原液和无菌培养滤液对苗期油菜菌核病均有良好的防治效果,其防效都在80%以上;菌株EDR2的喷施时间可影响其防治效果,其中以接种病菌前1d喷施防治效果最好,可达到95.4%;培养原液及不同倍数稀释液对病害的防治效果明显不同,随着稀释度的增加,其生防效果降低。菌株EDR2对供试的16种植物病原菌的菌丝生长均表现出一定的抑制作用,表现出较广的抑菌谱。结合形态和培养特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果认为,内生细菌EDR2属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。【结论】综合皿内及温室盆栽试验结果认为,内生枯草芽孢杆菌EDR2是1株对油菜菌核病具有较好防治潜力和开发前景的生防菌株。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

核盘菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因的 预测与生物信息学分析

为了解磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTases)在核盘菌生理代谢与致病过程中的作用,在核盘菌全基因组中寻找PPTases同源物。利用同源比对的方法,预测出核盘菌中PPTases基因,进而分析其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级、三级结构和保守结构域,并对PPTases编码氨基酸进行遗传进化分析。结果表明,在核盘菌全基因组中预测存在3个PPTases基因同源物,分别命名为:Ss-Ppt1、Ss-Ppt2和Ss-Ppt3。3个蛋白均为亲水性的非分泌型蛋白,在其二级和三级结构中α螺旋结构和无规则卷曲占主要部分,且三者都含有PPTases的保守结构域SCOP和(或)ACPS。     

1.2%瑞拉菌素水乳剂对油菜菌核病的防治效果

用100倍、300倍和500倍的1.2%瑞拉菌素水乳剂稀释液,通过室内离体叶片接菌、田间植株接菌和在自然发病情况下对油菜进行喷施药试验。结果表明,不同倍数稀释液1.2%瑞拉菌素水乳剂处理对油菜菌核病均有一定的防(抑)治效果。室内离体叶片接菌鉴定其抑制率分别为79.53%、68.27%、26.47%,田间接种鉴定的防治效果分别为30.1%、29.9%、19.12%,在不接种自然发病情况下,防治效果分别达到为70.89%、66.24%、34.20%。由此可见1.2%瑞拉菌素水乳剂能有效控制油菜菌核病害蔓延发展,保护油菜的运输器官,保护油菜叶片免收危害,确保油菜正常光合作用,增加粒质量和角粒数,增产保产效果明显。     

油菜内生拮抗细菌SF4对油菜菌核病菌的抑制作用研究

从油菜幼苗中分离出110个内生细菌。采用平板对峙法进行筛选,有4株菌对核盘菌有不同程度的抑制作用。经连续传代10次后,菌株SF4仍具有较高的生防活性。该菌株对核盘菌的菌丝生长发育有显著的抑制效果。在显微镜的观察下,被抑制的菌丝发生畸形,内含物分布不均匀。菌株SF4的挥发性产物及无菌发酵液都能抑制核盘菌的菌丝生长。挥发性产物对菌丝的最高抑制率为33.13%。无菌发酵液的抑制效果随培养时间的不同而有显著差异,96 h的无菌发酵液抑制效果最好。菌株SF4的无菌发酵液可推迟核盘菌菌核形成的时间,减少菌核数目,也可推迟菌核的萌发。在油菜叶片离体实验中,该菌株的菌悬液及无菌发酵液对发病有明显的抑制作用。     

安徽省油菜菌核病菌致病力分化研究

从安徽省13个油菜主产县市发病油菜上分离获得85个油菜菌核病菌菌株,采用离体叶片接种法测定了这些菌株对4个不同品种油菜的致病力,同时测定了全部供试菌株的菌丝生长速率和部分菌株的产草酸能力。结果表明,不同菌株对同一品种油菜的致病力存在显著差异;同一菌株对不同品种油菜的致病力也不同,4个油菜品种之间存在显著差异;不同地理来源的菌株对油菜的致病力存在显著差异。菌株的致病力强弱与产草酸能力呈显著正相关（R²=0.7429,P<0.05）,而与菌丝生长速率无显著相关性。     

土壤微生物中向日葵核盘菌抗性资源的挖掘及分子鉴定

为从不同来源土壤中筛选对向日葵菌核病具有较强拮抗能力的拮抗菌株,并进行分子鉴定,分别用PDA、MDA培养基培养核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌丝。结果表明,PDA培养基核盘菌菌丝生长较快,MDA培养基核盘菌菌核形成数量较多。从采集到的5个土壤样品中共分离到微生物单株26株,经过筛选,获得3株具有较好拮抗效果的细菌菌株,分别命名为BMD1、BMD2和BMD3。通过Blast对16SrDNA序列对比分析并结合构建系统发育树分析表明,BMD1与Bacillus subtilis(X60646)亲缘关系较近,序列相似度高于99%;BMD2与BMD3有2个碱基差异,二者同Bacillus pumilus(AB098578)、Bacillus altitudinis(AJ831842)、Bacillus stratosphericus(AJ831841)和Bacillus aerophilus(AJ831844)处于系统发育树同一分枝。     

植物内生放线菌Hhs.015T对油菜菌核病的防治效果

为有效地防治油菜菌核病,通过试验筛选得到一株植物内生放线菌Hhs.015^T,可显著抑制病原菌菌丝生长和菌核萌发。将Hhs.015^T的菌悬液和无菌上清液分别于接种前1 d、接种同时和接种后1 d 3个时期喷施油菜叶片和茎秆。结果表明,Hhs.015^T菌悬液和无菌上清液对油菜菌核病的防效之间不存在显著性差异,而不同喷施时期的防治效果则以接种同时喷施叶片的防效最好,菌悬液和无菌上清液防效分别可达91.06%和85.22%。大田试验中,于初花期喷施Hhs.015^T发酵液的防效可达41.27%,稀释后防治效果逐步降低。通过扫描电镜观察发现,Hhs.015^T对油菜菌核病菌菌丝生长具有明显抑制作用,并引起菌丝原生质体外渗、顶端膨大等现象;在菌丝侵染叶片时,能明显减少菌丝量,减缓侵染垫的形成,从而抑制菌丝的入侵。可见,植物内生放线菌Hhs.015^T具有较好生防潜力,可用于油菜菌核病的防治工作。     

cAMP抑制核盘菌菌核形成的差异基因表达分析

【目的】探究核盘菌响应环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）处理的转录组学特征,挖掘调控核盘菌菌核形成的关键基因,为靶向杀菌剂的研发提供参考。【方法】以接种在PDA培养基上生长至菌核原基形成时期的核盘菌作为CK1,开始形成黑色素时期的核盘菌作为CK2,以接种在PDA+5 mmol/L cAMP培养基上生长相同时间(5,7 d)的核盘菌作为试验组,依次命名为M1 和M2,对这4组样品进行转录组测序（RNA-seq）比较,阐释cAMP影响菌核形成的调控途径,挖掘菌核原基及菌核黑色素形成中的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。【结果】外源添加的cAMP主要在M1前期影响胞内的cAMP含量。差异表达基因分析结果显示,M1和CK1之间共有681个差异表达基因;KEGG富集分析显示,这些基因主要参与各类氨基酸代谢、脂肪酸代谢、MAPK信号通路等,且通路中的大部分基因都呈上调表达模式,而MAPK及其下游作用因子钙调磷酸酶B亚基（calcineurin B subunit,CnB）和热休克蛋白70（heat shock 70 ku protein,HSP70）则明显下调。M2和CK2之间共筛选到4 490个差异表达基因,主要参与各类氨基酸代谢、抗原加工提呈以及cAMP、MAPK等信号通路和自噬途径,通路中的大部分基因呈上调表达模式,且自噬相关因子ATG2、ATG20、ATG22、ATG23、ATG27和ATG29也大量上调表达,而与蛋白质和脂类合成相关的磷酸酶B（phosphatase B,PTPB）和酰基辅酶A氧化酶（acyl coenzyme A oxidase,ACO）的表达量则明显下调。在M1和M2时期,相关基因的qRT-PCR与RNA-seq差异表达分析结果趋势相同,说明转录组测序数据准确。【结论】核盘菌可通过吸收胞外高浓度的cAMP抑制菌核形成菌丝,其抑制作用主要通过影响相关蛋白质及脂类物质的合成而对菌丝形态及信号传递造成障碍。