犬弓首蛔虫MUC-1基因的克隆及序列分析

为研究犬弓首蛔虫(Toxocara canis,T.canis)黏蛋白1基因(Tc-MUC-1)的分子特征,该试验根据犬弓首蛔虫基因组数据库中的Tc-MUC-1基因序列设计引物,通过PCR技术克隆Tc-MUC-1全长基因,并进行多重序列比对和种系发育进化树分析.结果发现该基因全长为531 bp,编码176个氨基酸.功能结构域分析发现Tc-MUC-1蛋白包含1个由11个STSSSSA重复序列构成的Mucin结构域和2个ShKT结构域; GO分析显示具有蛋白质结合和金属离子结合功能;多重序列比对发现Tc-MUC-1与T.canis的其余4个黏蛋白(Tc-MUC-2-Tc-MUC-5)均含有2个由36个氨基酸组成的ShKT结构域;种系发育进化树分析显示Tc-MUC-1与双胃线虫(Pristionchus pacificus; GenBank No. PDM76930)和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans; GenBank No. NP491509)进化关系较近.     

犬弓首蛔虫enol-1基因的克隆及序列分析

对犬弓首蛔虫烯醇化酶(enolase)基因(enol-1)进行克隆及序列分析,预测其作为抗犬弓首蛔虫疫苗候选抗原的潜力。从犬弓首蛔虫的cDNA中扩增出enol-1基因,连接至pMD18-T载体,并筛选阳性克隆后,测序鉴定。将测序结果正确的核苷酸序列翻译成氨基酸序列,运用生物信息学软件分析enol-1蛋白的结构,预测抗原表位及功能位点,并运用Maximum likelihood(ML)法构建了系统发育树。结果表明:enol-1基因长1 311 bp,可编码437个氨基酸。Enol-1蛋白中包含18个α-螺旋区,7个β-折叠区,10个亲水区域和16个柔性区域,并预测含有9个线性B细胞抗原表位,enol-1蛋白可能具有潜在的免疫原性。并对犬弓首蛔虫enol-1基因进行了克隆及序列分析,为评价enol-1蛋白作为犬弓首蛔虫亚单位疫苗及表位疫苗奠定了基础。     

犬弓首蛔虫Tc-PEBP的分子特性及组织表达分析

为研究犬弓首蛔虫Toxocara canis 磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Tc-pebp)基因的分子特性, 本试验根据Tc-pebp基因的编码序列(GenBank No:AAC46843.1)设计引物,克隆、鉴定Tc-pebp 全长基因,并进行多重序列比对和种系发育进化树分析;采用 qRT-PCR检测Tc-pebp 基因在雌...     

弓首蛔虫和狮弓蛔虫线粒体nad1基因部分序列多态性研究

[目的]对弓首属犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓属狮弓蛔虫线粒体DNA（mtDNA）中烟酰胺脱氢酶亚基Ⅰ（nad1）基因部分序列（pnad1）进行比较研究，分析它们之间的序列差异和种群遗传关系。[方法]先用同位素（γ^33P）标记上下游引物，通过PCR方法扩增出单个虫体线粒体pnad1片段，然后采用单链构象多态性（SSCP）分析技术对pnad1片段进行多态性研究，最后挑选出代表性样品进行测序，并利用基因分析软件DNAStar（版本5．01）对序列进行分析比较。[结果]犬弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0．3％-1．9％，与猫弓首蛔虫、马来亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为11．0％～14．1％、10．7％～12．4％、12．6％～13．7％和17．5％～18．2％。猫弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为2．8％，与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12．0％～13．0％、15．1％和18．6％～21．2％。马来西亚弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0～0．3％，与牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12．4％～12．8％和18．6％～19．0％。[结论]犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和马来西亚弓首蛔虫不同地方虫株的pnad1序列都有一定差异（0～2．8%）。但种间pnad1的序列差异（10．7％～21．2％）明显高于种内的序列差异，说明nad1基因可以作为弓首蛔虫和狮弓蛔虫分子分类及种群遗传关系研究的遗传标记。     

犬弓首蛔虫黏蛋白2的原核表达及多克隆抗体的制备

根据犬弓首蛔虫(Toxocara canis)黏蛋白2的基因组数据(GenBank:AF167707),以T.canis成虫的基因组DNA为模板扩增Tc-muc-2基因并进行序列分析;同时构建Tc-muc-2/pCold TF原核表达载体,采用ITPG诱导表达,对重组蛋白进行纯化并制备多克隆抗体.结果显示Tc-muc-2基因全长序列为549 bp,共编码183个氨基酸;多重序列比对发现犬弓首蛔虫的黏蛋白均具有SKhT保守结构域,且含有不同串联重复序列组成的黏蛋白结构域;种系发育分析结果显示与猪蛔虫进化关系较近;SDS-PAGE结果表明重组蛋白Tc-MUC-2相对分子质量为7.5×10⁴,以可溶性形式表达;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,以250 mmol/L咪唑进行洗脱时可获得高纯度目的蛋白;将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,间接ELISA结果显示其多克隆抗体效价大于1∶512 000,表明重组蛋白的免疫原性较好,SDS-PAGE结果显示纯化后的抗体纯度高于95%, Western Blot结果显示抗体能与Tc-MUC-2蛋白特异性结合,表明...     

犬弓首蛔虫卵卵壳裂解方法研究

[目的]为犬弓首蛔虫卵壳的鉴定奠定基础.[方法]采用3种联合作用方法对犬弓首蛔虫卵壳进行裂解,提取虫卵基因组DNA,然后用犬弓首蛔虫的ITS2特异性引物进行PCR扩增.[结果]DNA提取试剂对虫卵卵壳的作用不明显,PCR扩增结果未见预期片段;冻融后抽提DNA对虫卵卵壳有一定作用,但大多数虫卵还保留基本形态,PCR扩增结果也未见预期片段;冻融15次+蛋白酶K消化2次过夜,然后抽提DNA,虫卵大多数被裂解,利用PCR扩增到目的片段.[结论]破坏犬弓首蛔虫卵的卵壳采用冻融+蛋白酶K消化的联合方式效果明显,关键因素是作用时间.     

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

【目的】对牦牛Cygb基因进行克隆与序列分析,为进一步深入研究Cygb基因在牦牛对低氧环境适应性中的作用提供理论基础。【方法】参照GenBank中牛的Cygb基因序列设计引物,提取牦牛肝组织RNA,以反转录合成的cDNA为模版,克隆牦牛Cygb基因并进行测序,运用生物信息学软件对所得序列进行分析。【结果】牦牛Cygb基因编码区全长573bp,编码190个氨基酸,编码产物分子质量21.5ku,理论等电点为6.61。蛋白预测表明,Cygb编码蛋白整体表现为亲水性,蛋白质的二级结构主要由α螺旋及延伸链构成。同源性分析表明,11条序列当中牦牛与牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,其中牦牛与牛的同源性最高,达到99.0%。【结论】克隆到573bp的牦牛Cygb基因编码区全长序列,该序列在哺乳动物中具有很高的保守性。     

犬弓首蛔虫卵黄原蛋白 DUF1943 结构域的克隆及原核表达

为克隆犬弓首蛔虫Toxocara canis,T.canis卵黄原蛋白DUF1943结构域(The domain of unknown function1943,DUF1943)(Tc-duf1943),构建其原核表达载体pET-28a(+)/duf1943,并检测重组蛋白在大肠杆菌Escherichia coli,E.coli中的表达形式.该文根据T.canis的转录组数据,以T.canis雌、雄虫cDNA为模板扩增Tcduf1943,然后与表达载体pET-28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,对目的蛋白的原核表达形式和蛋白质纯化进行鉴定.结果显示Tc-duf1943序列长度为864bp,含有一个完整的开放阅读框,编码288个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明,重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量大小约为3.5×10~4;对表达条件进行优化后,以0.4mmol/L IPTG,于37℃诱导4h时可获得大量目的蛋白;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化可以获得具有较高纯度的目的蛋白.该试验成功构建了pET-28a(+)/duf1943原核表达载体,为进一步研究TcDUF1943的生物学功能奠定了基础.     

牦牛TLR4基因的克隆测序及序列分析

旨在了解牦牛天然免疫受体TLR4基因特点。根据GenBank已公布的牛TLR4基因序列,分3段设计引物,测序、拼接克隆序列,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析表明,克隆得到牦牛TLR4基因编码区全长2 807bp,开放阅读框2 526bp,编码氨基酸841个,N端含有27个氨基酸组成的信号肽,分子质量96.009 8ku,理论等电点为6.35。蛋白预测结果表明,TLR4编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近。说明TLR4基因序列具有较高的保守性。     

犬冠状病毒V1株核蛋白基因的克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒V1野毒株核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中报道的CCV Insavc-1株N基因序列,设计了1对特异性引物,对分离的CCV V1野毒株进行了RT—PCR扩增;将扩增得到的阳性PCR片段经纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pTN1,进行核苷酸序列测定,并与GenBank中CCV标准毒株Insavrc—1 N基因进行了比较。结果该基因全长为1146bp,编码382个氨基酸,两者核苷酸的同源性为91．7％;推导的氨基酸序列的同源性为90．2％,显示出较高的保守性。在V1野毒株推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒相应区域相同,推测可能是RNA结合区。另外,推导的该蛋白氨基酸序列其疏水性和抗原表位与标准毒株Insavc-1 N蛋白存在一定的差异;在氨基酸组成上,该蛋白丝氨酸和赖氨酸含量高达9．84％,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构：     

梨小食心虫actin基因全长cDNA克隆与序列分析

为梨小食心虫其他基因表达调控研究提供内参基因以及actin基因的研究,运用RT-PCR和RACE技术,克隆获得梨小食心虫actin基因全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列全长为1 451bp,其中包括67bp的5′非编码区、253bp的3′非编码区和1 131bp的开放性阅读框,编码376个氨基酸。该蛋白预测分子质量为41.776 8ku,等电点为5.22,氨基酸序列中有6类功能位点,具有actin家族典型特征,与其他昆虫actin氨基酸序列高度同源,达97%~99%。成功克隆梨小食心虫actin基因全长cDNA,该序列已提交GenBank,登录号为KF022227。     

偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.     

罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析

为了解罗布麻査尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基。核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78%~81%,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守。     

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。     

梭梭糖基转移酶基因克隆及序列分析

以梭梭叶片为材料,根据其他植物糖基转移酶基因的保守序列设计引物,采用同源基因克隆及RACE-PCR方法克隆到2个同源的序列,分别命名为HaUGT1和HaUGT2。基因测序结果显示,HaUGT1基因编码区长1 485bp,编码495个氨基酸;HaUGT2基因编码区长1 185bp,编码394个氨基酸。HaUGT1和HaUGT2蛋白具有保守的PSPG基序、UDP-葡萄糖基转移酶结构域,与其他植物中的糖基转移酶蛋白同源性较高。     

普通小麦济麦21的LOX1基因cDNA片段克隆及分析

以普通小麦品种济麦21为材料,根据GenBank中已发表的LOX1基因序列设计引物,利用RTPCR技术获得一个小麦LOX1的基因片段,并对该片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆到的基因片段为384bp(GenBank登录号JX126806),GC含量为64.84%,推导氨基酸残基为127个,分子质量为11.15ku,等电点(pI)为4.93,与杜伦小麦、大麦、高粱、水稻的同源性分别为99.7%、94.8%、73.7%、56.2%。进化树分析表明,六倍体普通小麦LOX1基因与杜伦小麦LOX1基因(GenBank登录号HM126468)亲缘关系较近,先聚为一支,然后再与大麦的LOX1基因(GenBank登录号L35931.1)、高粱的LOX1基因(GenBank登录号GQ369443)聚为一类,最终与亲缘关系较远的水稻LOX1基因(GenBank登录号EU267789)聚类,这与物种亲缘关系的远近基本一致,表明所得LOX1基因片段可作为研究物种亲缘关系或遗传距离的参考标记之一。     

甜荞花同源异型基因FeMADS1的克隆和序列结构分析

采用同源克隆方法,并结合RACE技术,从甜荞花芽分离得到1个A类MADS-box基因FeMADS1的cDNA全长,GenBank登录号为KM386627,其cDNA全长1 107bp,包括1个编码234个氨基酸、长为705bp的开放阅读框。序列同源比对和分子系统发生分析表明,其蛋白与拟南芥AGL8(FUL)的相似性最高,属A类MADS-box基因亚家族中的euFUL进化系,含MADS、I、K和C末端4个明显的结构域,并且K结构域包含K1、K2和K3共3个保守的富含疏水氨基酸残基的亚结构域,C末端结构域含FUL型基因2个特有的模体:FUL motif和paleoAP1motfi。     

百合水通道蛋白LotNIP5-1基因的克隆及表达分析

为研究NIP5-1基因(Nodulin26-like intrinsic protein)在百合生长发育方面的作用机理,利用RACE技术克隆得到百合NIP5-1基因的全长cDNA序列。运用多个软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RT-PCR技术检测其表达特性。结果表明:1)百合NIP5-1基因全长为1 492bp,包含1个900bp的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF),共编码299个氨基酸;2)百合NIP5-1蛋白属于跨膜通道蛋白MIP超家族。具有6个跨膜区;在B、E环分别具有NIP5-1蛋白特有的NPS、NPV模体,具有该蛋白Ar/R filter分子筛特有的AIGR模体;与小果野芭蕉、香瓜、葡萄、黄瓜、番茄的相似性分别为86%、83%、84%、83%和82%;3)荧光定量结果显示,百合NIP5-1基因在茎中表达量最高,在花瓣中表达量较低,在叶、鳞茎、根中表达量均极低。RTPCR半定量检测显示,其在"湿"柱头上表达量显著高于"干"柱头,这与转录组测序结果相符合。上述研究暗示,百合NIP5-1可能是硼酸通道蛋白,在促进茎生长及生殖活动中发挥作用。     

马链球菌马亚种新疆株SeM基因的克隆及序列差异分析

为研究马链球菌马亚种新疆株SeM基因的分子特征,分析新疆地区马链球菌马亚种的分子流行特征以及为马腺疫的防治提供依据,对分离并鉴定的5株马链球菌马亚种提取基因组、扩增并克隆其SeM基因(GenBank登录号分别为:KJ486792、KJ486793、KJ486794、KJ486795、KJ486796),采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行疏水性、抗原性及三级结构分析,并与Genbank登录菌株的SeM基因序列进行系统进化分析和比较。克隆获得的SeM基因长度为1 530bp,包含1个1 527bp的完整开放阅读框,编码509个氨基酸;新疆分离株SeM基因与Genbank登录分离株SeM基因同源性为98.0%~99.4%。结果表明,新疆分离株KJ486793、KJ486796与美国分离株亲缘关系较近,属同一个进化分支,另外3株新疆分离株KJ486792、KJ486795、KJ486794构成一个独立分支。