拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型分析

【目的】建立拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型,分析明确不同来源拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型特点,比较不同拟斯卑尔脱山羊草及其与普通小麦的FISH核型差异。【方法】以荧光标记的寡核苷酸Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针,利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术分析pTa535和pSc119.2在不同拟斯卑尔脱山羊草、四倍体小麦和普通小麦染色体上的杂交信号分布特点;以禾本科植物着丝粒专化寡核苷酸Oligo-CCS1为探针,明确拟斯卑尔脱山羊草的着丝粒位置,测量拟斯卑尔脱山羊草染色体相关参数;通过FISH核型比较明确不同拟斯卑尔脱山羊草及其与小麦核型的多态性差异。【结果】Oligo-pTa535主要分布在小麦的D和A组染色体上,在小麦的B组染色体上仅有零星分布,在5份拟斯卑尔脱山羊草的染色体中未显示Oligo-pTa535杂交信号。Oligo-pSc119.2杂交信号主要分布在小麦的B组染色体上,在小麦的A、D组染色体中分布较少,但在5份拟斯卑尔脱山羊草染色体上均有广泛分布。根据Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2杂交信号在小麦染色体上的分布特点,可以将小麦的不同染色体相互区分开来。Oligo-pSc119.2杂交信号在不同倍性、不同品种的小麦B组染色体上的分布特点基本相似,而不同来源拟斯卑尔脱山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差异较大,甚至在同一细胞内的2条同源染色体上Oligo-pSc119.2杂交信号的分布也具有明显差异。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异。PI542238的7对染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式为2n=14=14m。其余4份拟斯卑尔脱山羊草的4S染色体均为近中着丝粒染色体,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式皆为2n=14=12m+2sm。【结论】拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc119.2高度同源的重复序列,不含有与pTa535高度同源的重复序列。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草之间以及同一来源的拟斯卑尔脱山羊草的个体间甚至同一个体内的同源染色体间在pSc119.2的分布上均具有遗传多样性。以Oligo-pSc119.2为探针建立的拟斯卑尔脱山羊草染色体FISH核型与小麦B组染色体的核型具有显著差异。利用荧光标记的Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针进行FISH分析,可以准确区分拟斯卑尔脱山羊草的不同染色体,并能将拟斯卑尔脱山羊草与小麦的染色体区分开来。     

用荧光原位杂交技术检测黑麦染色质

荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization ,FISH）是一种快速、准确、直接检测和定位外源染色质的新技术。本研究荧光原位杂交用毛地黄毒苷-11-dUTP标记黑麦总DNA作探针,以检测小麦中黑麦染色质。结果如下：八倍体小黑麦（2n=8x=56）有丝分裂中期有14条染色体显示黄色,42条染色体显示红色,红色间期核显示有14个黄色亮点,表明这八倍体小黑麦含14条黑麦染色体。八倍体小黑麦中黄色黑麦染色体显C-带和H-带的末端有绿色的带。这是由于黑麦染色体末端结构异染色质含量高所致。黑麦附加系2R的间期细胞核中有1 ～ 2个黄色亮点。这表明2R含有1至2条黑麦染色体。     

利用C基因组DNA和C0t-1 DNA对药用野生稻、大颖野生稻基因组的比较分析

采用药用野生稻C基因组DNA及C0t-1 DNA为探针,分别对药用野生稻(CC)自身和大颖野生稻(CCDD)体细胞染色体进行了基因组原位杂交(GISH)和荧光原位杂交(FISH)分析。利用C基因组DNA探针进行分析显示,药用野生稻24条染色体都被杂交信号覆盖;而在大颖野生稻中可区分为24条CC型染色体(杂交信号较强)和24条DD型染色体(杂交信号较弱)。以C基因组C0t-1 DNA探针进行分析显示,在药用野生稻染色体的端粒、着丝粒、近着丝粒区域有很强的杂交信号,而大颖野生稻中也有24条染色体在这些区域红色杂交信号较强,另24条染色体的杂交信号很弱。表明利用C基因组DNA和C0t-1 DNA为探针的GISH和FISH技术,都能很好地将大颖野生稻C、D染色体组区分开,C和D基因组亲缘关系较远,二者具有不同起源。与药用野生稻C基因组相比,大颖野生稻C基因组出现了一些分化。这些都为研究大颖野生稻C和D染色体组起源,探讨异源四倍体进化机制奠定了基础。     

黑麦端部特异重复序列pSc200在新合成的不同小麦-黑麦双二倍体中的变异

【目的】更好地了解在小麦-黑麦双二倍体形成过程中,黑麦染色体变异的情况。【方法】利用黑麦Kustro及黑麦AR106BONE分别与小麦品种绵阳11杂交,获得两种双二倍体（MKS1及MARS1）。以黑麦亚端部串联重复序列pSc200为探针,采用荧光原位杂交的方法,分析亲本黑麦及相应的双二倍体中黑麦染色体端部染色体结构变化。【结果】检测到pSc200杂交位点在MKS1中减少,而在MARS1中增加。【结论】异源多倍体化过程中,染色体端部结构的变异是伴随多倍体化快速发生的。这可能有利于新合成的异源多倍体快速稳定,使得两个不同的基因组在同一核中协调共存。来自不同组合的小麦－黑麦双二倍体中,黑麦染色体结构发生不同的变异为黑麦在小麦育种中的应用提供了启示。     

济麦系列小麦荧光原位杂交(FISH)分析

以多聚核苷酸Oligo-p Ta535-1和Oligo-p Sc119.2-1为探针对济麦系列小麦进行双色荧光原位杂交(FISH)分析,结果发现,Oligo-p Ta535-1的FISH信号主要分布在A和D染色体上,而Oligop Sc119.2-1的FISH信号主要分布在B染色体上;济麦系列小麦的FISH位点较小麦中国春差异位点主要集中在染色体4A、6B、7B和1D染色体上,且多为Oligo-p Sc119.2-1信号;济南17的1B染色体着丝粒区Oligo-p Ta535-1信号、济麦20的1D短臂末端和2A长臂末端的Oligo-p Sc119.2-1信号、济麦262的5A长臂中间的Oligo-p Sc119.2-1信号可分别作为细胞学标签用于其身份识别。济麦系列小麦标准FISH核型的建立为利用染色体工程对其进行改良奠定了良好的细胞遗传学基础;FISH信号变异位点的类似性,说明济麦系列小麦的遗传基础相对狭窄,应在今后育种工作中注意选择与其亲缘关系相对较远的育种亲本进行组配。     

黑麦特异DNA重复序列的分离与鉴定

为了找到黑麦特异的DNA重复序列，我们采用随机扩增多态性DNA（RAPD）标记对黑麦、小麦及其他麦类植物材料分析发现引物OPH20在所有黑麦中扩增出特异的两条带。将这两条带DNA回收克隆测序，得到两序列的长度分别为1495bp、1147bp，分别命名为pSc20H．1、pSc20H．2。序列比对发现pSc20H．1的序列与已报道的序列pSc20n（GenBank编号AF305943）一致达到97％。没有与pSc20H．2高度一致的同源序列。荧光原位杂交结果显示pSc20H．1分布黑麦所有染色体的除端部和核仁组织区域的所有部位。pSc20H．2也分布在黑麦所有染色体上，但分布区域不同于pSC20H．1。证明了pSc20H．2是黑麦新的特异DNA序列，并可用于检测小麦背景中的黑麦染色体成分。     

黑麦CenH3基因克隆及其在小麦1BL/1RS易位染色体中的定位

黑麦属蕴藏着丰富的遗传变异和改良小麦品质的优良基因,将其导入小麦能够拓宽小麦的遗传基础、丰富小麦的遗传变异。研究采用分子克隆技术获得黑麦CenH3基因的部分片段,并进行探针标记;同时,利用基因组原位杂交技术,筛选出32份1BL/1RS易位系;应用FISH技术,检测筛选出的32份1BL/1RS易位系,所有1BL/1RS易位系材料中均未发现黑麦CenH3基因的信号。但是,应用小麦和黑麦特异着丝粒DNA序列进行FISH检测,2个信号均出现在所有被检测的1BL/1RS易位系材料中。说明1BL/1RS易位染色体在不同小麦背景和山羊草属背景中均能稳定遗传,1RS的着丝粒DNA序列对1BS的着丝粒DNA序列有很好的补偿性,与小麦CenH3蛋白相互作用指导易位染色体正确分离且稳定遗传。     

麦类作物DNA原位杂交及其在远缘杂种染色体分析中的应用

 应用生物素标记的物种基因组DNA探针和克隆的专化性探针，对六倍体小黑麦双二倍体及其杂种和八倍体小麦簇毛麦双二倍体及其杂种进行了染色体DNA原位杂交。结果表明，应用这两种探针均可以准确地检测出小麦远缘杂种中的异源染色体和染色体片段。先后对二个六倍体小黑麦双二倍体（Badger、M#-2A）、一个八倍体小簇麦双二倍体、三个小黑麦易位系（宁麦8026、Amigo、Apollo）、一个小黑麦代换系（84056）和二个小簇麦附加系（94009-5-4、94009-5-9）进行原位杂交和异源染色体的检测，均获得较好的结果。此外，还讨论了应用生物素标记的探针进行原位杂交可能出现的一些技术问题。     

普通小麦大赖草易位系T3AS·3AL-7Lr#1S的分子细胞遗传学鉴定

大赖草对赤霉病具有较好的抗性,将大赖草赤霉病抗性基因转入普通小麦,对拓宽小麦赤霉病抗性基础有重要意义。本研究在获得抗赤霉病普通小麦-大赖草异附加系基础上,采用1 200 R ⁶⁰Co-γ射线处理小麦-大赖草二体附加系DA7Lr花粉,授予已去雄的普通小麦中国春,对其后代(M₁)种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析,获得了1株具有1条普通小麦-大赖草易位染色体的植株,让其自交,对自交后代中具有2条易位染色体植株的花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ进行观察,发现2条易位染色体形成了稳定的环状二价体,表明该植株为纯合体。利用顺序GISH-双色FISH分析,结合C-分带、小麦D基因组专化探针Oligo-pAs1-2和B基因组专化探针Oligo-pSc119.2-2,进一步鉴定出该普通小麦-大赖草易位系为T3AS·3AL-7Lr#1S,且筛选出了可追踪该易位系的3个EST-STS分子标记BE591127、BQ168298和BE591737。该易位系的育成为小麦赤霉病遗传改良提供了新种质。     

利用SLAF-seq技术开发新寡核苷酸探针鉴定小麦背景中的黑麦染色体

【目的】通过荧光原位杂交(FISH)技术能有效地检测小麦背景中的黑麦染色体,进一步发现利用寡核苷酸探针和非变性FISH(ND-FISH)技术可以提高黑麦染色体的检测效率。【方法】通过借助SLAF-seq(specific length amplified fragment sequencing)和生物信息学方法开发寡核苷酸探针。【结果】开发了3种新的寡核苷酸探针Oligo-2874、Oligo-5296和Oligo-9965,它们可用于ND-FISH分析。通过与小麦背景中的黑麦染色体端部和亚端部特异杂交,从而达到识别黑麦染色体的目的。【结论】这些寡核苷酸探针可以用于快速高效地鉴定小麦背景中的黑麦染色体,丰富了小麦-黑麦杂交后代FISH分析的探针源。研究结果也表明SLAF-seq技术可以用来开发小麦近缘种属特异的重复序列FISH分析探针。     

Identification and genetic analysis of multiple P chromosomes of Agropyron cristatum in the background of common wheat

Agropyron cristatum, a wild relative of common wheat (Triticum aestivum L.), provides many desirable genetic resources for wheat improvement, such as tolerance to cold, drought, and disease. To transfer and utilize these desirable genes, in this study, two wheat-A. cristatum derivatives II-13 and II-23 were identified and analyzed. We found that the number of root tip cell chromosomes was 44 in both II-13 and II-23, but there were four and six P genome chromosomes in II-13 and II-23, respectively, based on genomic in situ hybridization (GISH). The chromosome configurations of II-13 and II-23 were both 2n=22II by the meiotic analysis of pollen mother cells (PMCs) at metaphase I, indicating that there were two and three pairs of P chromosomes in II-13 and II-23, respectively. Notably, wheat chromosome 7D was absent in derivative line II-13 while II-23 lacked chromosomes 4B and 7A based on SSR analysis combining fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis with pAs1 and pSc119.2 as probes. Chromosomes 2P and 7P were detected in both II-13 and II-23. Another pair of P genome chromosomes in II-23 was determined to be 4P based on expressed-sequences tags-sequence tagged sites (EST-STS) markers specific to A. cristatum and FISH with probes pAcTRT1 and pAcpCR2. Overall, these results suggest that II-13 was a 7P (7D) substitution line with one pair of additional 2P chromosomes and II-23 was a multiple 4P (4B), 7P (7A) substitution line with one pair of additional 2P chromosomes. Moreover, we obtained six alien disomic addition lines and five alien disomic substitution lines by backcrossing. These new materials will allow desirable genes from A. cristatum to be used in common wheat.     

普通小麦-长穗偃麦草异附加系的分子标记鉴定

利用分布于小麦7个部分同源群的1 246对引物对15个可能的小麦-长穗偃麦草二体异附加系的4个亲本的基因组DNA进行扩增。结果表明,186对SSR、209对EST-SSR和22对STS引物能够在长穗偃麦草中扩增出不同于其他3个小麦亲本的特异条带,其中18对引物可以在14个附加系中的1~7个附加系扩增出长穗偃麦草的特异带,说明它们可能添加长穗偃麦草的遗传物质。5个附加系(1-3、1-8、1-27、2-6和2-22)可能含有长穗偃麦草第7同源群染色体,4个附加系(5-10、5-20、6-23和6-18)可能含有长穗偃麦草第6同源群染色体。附加系1-13可能附加2条不同同源群的长穗偃麦草染色体。同时发现,小麦与长穗偃麦草杂交及其后代衍生过程中长穗偃麦草染色体间可能发生遗传重组。     

海岛棉GbHCT基因的表达分析

通过海岛棉基因组数据库和GSDS 2.0在线生物信息学软件,分析GbHCT基因的结构,利用实时荧光定量PCR技术,检测GbHCT基因在海岛棉不同组织和棉纤维不同发育时间的表达量。结果表明,该基因DNA序列长度为1 953bp,开放阅读框长度为1 311bp,编码436个氨基酸,在海岛棉基因组中对应scaffold3453序列,含有1个内含子和2个外显子。GbHCT基因在不同组织和纤维发育不同时期中均有表达,在各个组织中,苞叶和花中表达量最高,在棉纤维不同发育时期开花后5d和25d表达量最强。该基因可能参与棉纤维发育伸长期和次生壁增厚期。为深入研究该基因的功能,构建植物表达载体pEGAD-GbHCT并转入根癌农杆菌,为下一步研究奠定试验基础。     

提莫菲维小麦与光稃野燕麦易位系TGF314的顺序C-分带-基因组原位杂交鉴定

采用顺序C-带-基因组原位杂交（GISH）技术对提莫菲维小麦与光稃野燕麦远缘杂交后代中的外源遗传物质进行鉴定。GISH分析结果表明，在根尖细胞有丝分裂中期染色体具有2对清楚的杂交信号，说明该后代中可能含有稳定的外源遗传物质，且以易位的染色体片段形式存在。对该后代进行顺序C-带-GISH分析将杂交信号分别定位于提莫菲维小麦的7A和6G染色体短臂上，提莫菲维小麦的7A和6G染色体中含有光稃野燕麦的遗传物质。     

小麦TaSIM基因结构及表达分析

根据小麦TaSIM基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从小麦中克隆TaSIM基因的DNA序列,采用半定量RT-PCR方法研究TaSIM基因在不同组织中的表达。结果表明:TaSIM编码区DNA序列长度为2 355bp,包含2个外显子和1个内含子。分析发现内含子富含AT,在内含子中发现2个MYB转录因子结合位点。半定量RT-PCR检测表明,TaSIM基因在不同组织中均有表达,在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。     

Comparative analysis of genomes in Oryza sativa, O. officinalis and O. meyeriana with C 0 t-1 DNA and genomic DNA of cultivated rice

Fluorescence in situ hybridization (FISH) and comparative genomic hybridization (CGH) were applied to somatic chromosome preparations of Oryza sativa, O. officinalis and O. meyeriana with labeled probes of C ₀ t-1 DNA and genomic DNA from cultivated rice. The coverage percentage (%) and size (Mb) of C ₀ t-1 DNA in O. sativa, O. officinalis and O. meyeriana were 47.1 ± 0.16, 38.61 ± 0.13, 44.38 ± 0.13 and 212.33 ± 1.21, 269.42 ± 0.89, 532.56 ± 1.68, respectively. The coverage percentage and size of probe signals with genomic DNA from O. sativa in O. officinalis and O. meyeriana were 91.0%, 93.6% and 634 Mb, 1 123 Mb respectively, in which there were 365 and 591 Mb in O. officinalis and O. meyeriana which came from O. sativa genomic DNA not from repetitive sequences of O. sativa, and the uncovered genome size in O. officinalis and O. meyeriana was 64 and 78 Mb, respectively. In addition, karyotype analysis was conducted based on the signal bands of C ₀ t-1 DNA in O. sativa, O. officinalis and O. meyeriana. The results showed that highly and moderately repetitive sequences in Oryza genus were conserved as the functional genes during the evolution process. The repetitive sequence reduplication might be one of the important causes of genome enlargement in O. officinalis and O. meyeriana; the O. officinalis genome enlarged more slowly compared with O. meyeriana. Based on the above results, it is concluded that O. officinalis and O. meyeriana formed by reduplication, rearrangement and gene selective loss during the evolution process. Translated from Scientia Agricultura Sinica, 2006, 39(6): 1083–1090 [译自: 中国农业科学]     

基于种特异性线粒体细胞色素氧化酶I引物快速鉴定茄二十八星瓢虫和马铃薯瓢虫

【目的】茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata和马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata都是茄科作物上的重要害虫,对茄科作物造成极大的经济损失。这2种瓢虫由于外形非常相似,无法通过体表特征区分,因此很有必要开发一种准确且快速的区分方法。【方法】基于这2种瓢虫线粒体细胞色素氧化酶I(Mitochondrial cytochrome oxidase I, mtCOI)的物种特异性,利用种特异性(Species-specific,SS)PCR引物建立了一种分子鉴定技术,即以茄二十八星瓢虫和马铃薯瓢虫之间的mtCOI基因序列变异为基础,设计了2对SS-mtCOI引物Hvp和Hvm。【结果】用这2对引物进行PCR扩增,均出现物种特异性扩增现象。在不同的DNA质量浓度下对该SS-mt COI引物进行敏感性检测,结果表明,Hvp引物在茄二十八星瓢虫DNA质量浓度为3.13 mg/L时仍可检测到扩增条带,Hvm引物在马铃薯瓢虫DNA浓度为2.43 mg/L时仍能检测到扩增条带。此外,Hvp和Hvm引物也能准确鉴定马铃薯瓢...     

高抗白粉病小麦-山羊草新种质TA002的创制和遗传研究

【目的】小麦白粉病是世界范围内对小麦危害最严重的病害之一。培育和推广抗病品种是防治小麦白粉病最经济、有效、安全的途径。偏凸山羊草和柱穗山羊草是普通小麦的近缘物种,蕴藏着丰富的抗病、抗虫、抗逆和优质等优异基因。利用远缘杂交途径,将偏凸山羊草和柱穗山羊草的抗白粉病基因导入普通小麦,培育抗白粉病小麦新种质,为小麦白粉病抗性遗传改良提供新抗源。【方法】通过细胞学分析和结实率调查,明确TA002及其与普通小麦杂种的细胞学稳定性和育性特点。利用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳（odium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）及酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（acid polyacrylamide gel electrophoresis,A-PAGE）方法,分析TA002的高分子量麦谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS）、低分子量麦谷蛋白亚基（low molecular weight glutenin subunit,LMW-GS）及醇溶蛋白亚基组成;通过白粉病菌分小种接种鉴定,明确TA002对小麦白粉病的抗性及其遗传特点;利用基因组原位杂交（genomic in situ hybridization,GISH）、多色原位杂交（multicolor genomic in situ hybridization,mc-GISH）、多色荧光原位杂交（multicolor fluorescence in situ hybridization,mc-FISH）及分子标记技术,分析明确TA002的染色体组成特点。【结果】TA002染色体数目为42条,它及其与普通小麦的杂种F₁减数第一次分裂中期细胞（pollen mother cells at metaphase I,PMCs MI）均含有21个二价体,减数第一次分裂后期细胞（pollen mother cells at anaphase I,PMCs AI）中的染色体分离均衡,结实率正常。在成株期,TA002、SDAU18及其双亲偏凸山羊草和柱穗山羊草对白粉病均具有良好抗性,而烟农15对白粉病表现髙感。TA002/辉县红F₁、TA002/铭贤169F₁对白粉病菌种E09表现免疫,F₂单株对E09的抗感分离比例符合3﹕1。种子贮藏蛋白分析结果表明,在TA002的醇溶蛋白和谷蛋白中均含有SDAU18的特有亚基,其醇溶蛋白还含有双亲没有的新型亚基。分别以单芒山羊草和尾状山羊草的基因组总DNA为探针,烟农15的基因组总DNA为封阻,对TA002的根尖细胞染色体进行基因组原位杂交,均未检测到杂交信号。同时以不同荧光素标记的乌拉尔图小麦和粗山羊草基因组总DNA为探针,拟斯卑尔脱山羊草基因组总DNA为封阻,对TA002的根尖细胞染色体进行mc-GISH,并利用以不同荧光素标记的寡核苷酸pSc119.2和pTa535对TA002的根尖细胞染色体进行mc-FISH,发现TA002具有完整的A、B和D基因组,但其4A、5A、6B、7B和5D染色体在FISH带型上与亲本烟农15的对应染色体具有显著差异。分子标记检测结果表明,TA002含有来源于偏凸山羊草和柱穗山羊草的遗传物质。【结论】TA002是一个细胞学稳定、农艺性状和育性良好的小麦-山羊草渐渗系,它含有偏凸-柱穗山羊草双二倍体特有的贮藏蛋白亚基及其双亲没有的新亚基,且高抗小麦白粉病,其白粉病抗性受显性单基因控制,该基因可能是来自偏凸山羊草或柱穗山羊草的一个新的白粉病抗性基因。     

镉胁迫对青菜幼苗某些生理特性以及基因组多态性的影响

以青菜品种"苏州青"为试材,采用生理生化方法和随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,研究了镉(Cd)胁迫对青菜幼苗相关生理特性以及基因组多态性的影响。结果表明:不同浓度(1、5、10、20、40 mg·L-1)的Cd处理20 d后,青菜幼苗的鲜重、根伸长受到显著抑制,叶片的叶绿素以及蛋白质含量下降,丙二醛含量和细胞膜透性增加。选用8条寡核苷酸引物(10 bp)对青菜幼苗基因组DNA进行RAPD扩增,对照组的RAPD图谱中可分辨出55条谱带,Cd胁迫后的RAPD图谱发生改变,呈现谱带的增加、缺失和荧光强度的改变,并且与Cd浓度剂量-效应相关。随着Cd浓度的增加,幼苗叶片基因组的模板稳定性逐步下降,并且RAPD多态性与青菜幼苗的生理指标具有显著的相关性。以上结果表明,利用RAPD技术获得的DNA多态性变化谱带可作为检测Cd对青菜毒性效应的生物标记物。