重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米粘虫肠道细菌比较

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)于2019年5月被发现已经入侵至重庆地区, 6月底在江津地区的高粱地中也发现了少量的草地贪夜蛾,同时还发现了大量玉米黏虫(Mythimna seperata).通过分离培养同一生境内的草地贪夜蛾和玉米黏虫的肠道细菌,结合16S rDNA测序完成了这两种害虫肠道优势菌属水平的鉴定,共分离得到了19个细菌分离株,其中分离自草地贪夜蛾肠道细菌归为5个属,分别为欧文氏菌属(Erwinia),不动杆菌属(Acinetobacter),肠杆菌属(Enterobacter),肠球菌属(Enterococcus),假单胞菌属(Pseudomonas).分离自玉米黏虫肠道细菌归为6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella),不动杆菌属(Acinetobacter),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),肠球菌属(Enterococcus),金黄杆菌属(Chryseobacterium),芽孢杆菌属(Bacillus).同时我们也对采自玉米地和高粱地的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析,在江津高粱地中的草地贪夜蛾中没有发现克雷伯氏菌,但该菌在巫山、巫溪玉米地的草地贪夜蛾中大量存在.结论为进一步研究草地贪夜蛾幼虫肠道核心微生物群奠定了基础.     

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾与玉米黏虫肠道细菌比较

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)于2019年5月被发现已经入侵至重庆地区, 6月底在江津地区的高粱地中也发现了少量的草地贪夜蛾,同时还发现了大量玉米黏虫(Mythimna seperata).通过分离培养同一生境内的草地贪夜蛾和玉米黏虫的肠道细菌,结合16S rDNA测序完成了这两种害虫肠道优势菌属水平的鉴定,共分离得到了19个细菌分离株,其中分离自草地贪夜蛾肠道细菌归为5个属,分别为欧文氏菌属(Erwinia),不动杆菌属(Acinetobacter),肠杆菌属(Enterobacter),肠球菌属(Enterococcus),假单胞菌属(Pseudomonas).分离自玉米黏虫肠道细菌归为6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella),不动杆菌属(Acinetobacter),寡养单胞菌属(Stenotrophomonas),肠球菌属(Enterococcus),金黄杆菌属(Chryseobacterium),芽孢杆菌属(Bacillus).同时我们也对采自玉米地和高粱地的草地贪夜蛾肠道微生物优势菌进行了比较分析,在江津高粱地中的草地贪夜蛾中没有发现克雷伯氏菌,但该菌在巫山、巫溪玉米地的草地贪夜蛾中大量存在.结论为进一步研究草地贪夜蛾幼虫肠道核心微生物群奠定了基础.     

重庆地区取食高粱的草地贪夜蛾肠道细菌新分离株的鉴定

为充分认识入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的肠道微生物, 2019年7月该课题组再次在重庆江津地区高粱地采集了草地贪夜蛾幼虫,通过分离培养结合16S rDNA测序鉴定,从江津草地贪夜蛾幼虫肠道中共分离得到38个细菌分离株,归为9个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌属(Enterococcus)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium).在课题组前期研究的基础上,新分离到了6个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium).同时还对入侵重庆地区采食高粱和玉米的草地贪夜蛾幼虫肠道细菌分离株进行了比较分析,只在采食高粱的草地贪夜蛾幼虫肠道中发现了欧文氏菌属(Erwinia)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的菌株,而气单胞菌属(Aeromonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)和类香味菌属(Myroides)则只在采食玉米的草地贪夜蛾幼虫肠道中分离得到.通过对同一片江津高粱地的草地贪夜蛾和玉米黏虫(Mythimna separata)的肠道细菌分离株进行比较分析,只在草地贪夜蛾肠道中发现了微球菌属(Micrococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和鞘脂杆菌属(Sphingobacterium),而金黄杆菌属(Chryseobacterium)只发现于玉米黏虫肠道中.     

重庆巫山地区采食玉米的草地贪夜蛾肠道细菌的分离鉴定补遗

为充分认识入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道所携带的细菌组成,以采集自巫山地区玉米地的草地贪夜蛾为材料,在课题组前期研究基础上进一步分离培养并通过16S rDNA测序鉴定了3个未报道的分离株,分别归为短波单胞菌属(Brevundimonas)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)以及肠球菌属(Enterococcus).结论进一步丰富了入侵重庆巫山地区草地贪夜蛾肠道优势细菌的种类,为后续研究草地贪夜蛾肠道微生物对宿主的生长发育以及迁飞等重要问题奠定了基础.     

重庆地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离鉴定

为了解入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道所携带的细菌组成,以采集自巫溪、巫山地区玉米地里的草地贪夜蛾为材料,运用传统培养方法分离了其肠道优势细菌,并基于16S rDNA测序开展了优势菌的属水平鉴定,共获得了30个细菌分离株,经16S rDNA序列同源性分析,可归于5个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)以及气单胞菌属(Aeromonas);其中,克雷伯氏菌属(Klebsiella)的丰度最高,占所有分离菌株的63%;假单胞属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)菌株仅在巫山地区分离得到,气单胞菌属(Aeromonas)仅在巫溪地区分离得到.实验确定了入侵重庆地区草地贪夜蛾肠道优势细菌的种类及丰度,为后续研究草地贪夜蛾肠道微生物对宿主的生长发育以及迁飞等重要问题奠定了基础.     

云南地区草地贪夜蛾肠道细菌的分离及鉴定

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)自2019年1月入侵中国以来,现已蔓延至全国25个省份.为了解草地贪夜蛾的肠道微生物的组成,近期该课题组在云南蒙自地区的玉米地采集了草地贪夜蛾幼虫及成虫,通过分离培养结合16S rDNA测序鉴定其肠道细菌分离株的种属.在幼虫肠道中分离到32个细菌分离株,通过16S rDNA序列同源聚类可归为4个属,分别为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌属(Enterococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)和摩根菌属(Morganella),其中克雷伯氏菌属(Klebsiella)丰度最高,为53.1%;在成虫肠道中分离到16个细菌分离株归为5个属,分别为不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、微球菌属(Micrococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter),其中不动杆菌丰度最高,为56.0%.该研究首次对入侵中国的草地贪夜蛾成虫肠道细菌进行分离鉴定,为后续研究草地贪夜蛾生物学适应性等重要问题奠定了基础.     

云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌种类及对抗生素的敏感性

[目的]明确云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌种类及优势种细菌对抗生素的敏感性,为草地贪夜蛾的绿色防控提供参考.[方法]采用常规分离培养法对云南省芒市玉米田草地贪夜蛾5龄幼虫肠道可培养细菌进行分离培养,采用形态特征和16S rDNA技术对细菌种类进行鉴定;采用纸片扩散法测定优势种细菌对10种抗生素的敏感性.[结果]云南省芒市玉米田草地贪夜蛾5龄幼虫肠道内可培养细菌有3门5科5属6种,分别为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarum)、普罗威登斯菌(Providencia vermicola)、金黄微杆菌(Chryseomicrobium aureum)和Kocuria himachalensis,其中变栖克雷伯氏菌是草地贪夜蛾幼虫肠道的优势种细菌.变栖克雷伯氏菌对10种抗生素的敏感性测定结果表明,变栖克雷伯氏菌对诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、氯霉素和头孢唑林敏感,表现为低耐药性;对庆大霉素和阿米卡星中等敏感,表现为中等耐药性;对青霉素、红霉素和氨苄西林的敏感性较弱,表现为强耐药性.[结论]云南省芒市草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌组成具有多样性,其中变栖克雷伯氏菌为优势种细菌,该优势种细菌对青霉素、红霉素和氨苄西林存在明显的耐药性.     

草地贪夜蛾与黏虫肠道微生物的多样性分析

通过比较分析对食用玉米叶的草地贪夜蛾与黏虫体内肠道共生菌进行比较分析,研究玉米叶内生细菌的组成与草地贪夜蛾和黏虫肠道微生态的相互关系。选用玉米叶饲养的草地贪夜蛾和黏虫,通过16S rDNA全长扩增子测序,比较分析其肠道菌群多样性和丰富度。由α多样性研究结果可知,草地贪夜蛾和黏虫肠道菌群多样性、物种丰富度比较接近;β多样性分析结果也表明,草地贪夜蛾和黏虫肠道菌群落结构相似性较高。KEGG通路功能预测结果表明,草地贪夜蛾和黏虫肠道菌群中均以代谢功能占比最高,主要涉及糖类代谢、氨基酸代谢和能量代谢。同样取食玉米叶的草地贪夜蛾和黏虫的肠道细菌在门水平上的核心菌群相同,在属水平上的优势菌属丰度和物种多样性差异不大,群落结构相似度高,菌群功能差异不显著,其原因可能是物种遗传特点相似、取食食物和生长环境中微生物种类相同。     

云南不同地理种群草地贪夜蛾肠道可培养细菌多样性分析

【目的】明确云南不同地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌群落组成及种群间的差异,为草地贪夜蛾肠道细菌多样性及其生物学功能研究提供科学依据,并为解析草地贪夜蛾的环境适应机理打下基础。【方法】采用分离培养法对云南省普洱市澜沧、保山市隆阳、昆明市石林、红河州开远4个不同地理种群的草地贪夜蛾幼虫肠道细菌进行分离培养,结合形态学及16S rDNA测序方法进行细菌种类鉴定。【结果】从云南4个地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道中共分离获得27株形态、颜色和大小各异的细菌菌株,27株细菌菌株分属4门9科12属19种,优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),优势菌属为厚壁菌门肠球菌属(Enterococcus)。其中,澜沧、石林、开远和保山种群分别分离到3门4科6属8种共9株细菌、3门5科6属6种共6株细菌、2门3科4属5种共5株细菌和3门6科6属6种共7株细菌;4个地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道内均存在肠球菌属和克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌;4个地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道细菌的丰富度指数、Shannon指数、Simpson指数和均匀度指数分别为0.705~1.277、0.969~1.381、0.615~0.635及0.602~0.753。【结论】云南4个不同地理种群草地贪夜蛾幼虫肠道内可培养细菌较丰富,不同地理种群肠道细菌多样性存在差异,但优势菌均为厚壁菌门的肠球菌属细菌,肠球菌属细菌对草地贪夜蛾肠道细菌群落起着决定作用。     

重庆地区草地贪夜蛾幼虫肠道真菌的分离鉴定

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)是一种洲际迁飞性农业害虫,食谱广泛. 2019年5月已迁飞至重庆地区,对农作物造成严重危害.为了解入侵重庆地区草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)肠道真菌菌群的组成,本研究以采集自重庆巫山玉米田及重庆江津高粱田中的草地贪夜蛾幼虫为材料,运用传统培养方法分离其粪便中的肠道优势真菌,并对其进行形态学观察和分子生物学鉴定.实验通过分离培养不同地区、不同食物的草地贪夜蛾肠道真菌,结合形态学观察及rDNA ITS测序完成了属水平的鉴定,共分离得到了5个属10个真菌分离株,其中分离自重庆巫山玉米田的草地贪夜蛾肠道真菌归为3个属,分别为念珠菌属(Candida)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和帚枝霉属(Sarocladium);分离自重庆江津高粱田的草地贪夜蛾肠道真菌归为3个属,分别为念珠菌属(Candida)、莫氏黑粉菌属(Moesziomyces)和毛霉属(Mucor).初步分离获得入侵重庆地区的草地贪夜蛾肠道真菌,丰富了对入侵草地贪夜蛾肠道微生物的认识.     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

玉米内生细菌的动态分布及拮抗作用

[目的]比较不同品种及生育期玉米内生细菌的多样性差异,对分离到的内生细菌的拮抗作用进行鉴定。[方法]以桂单0810、迪卡008、正大619玉米品种苗期和穗期的不同组织为研究对象,采用组织研磨匀浆方法分离培养内生细菌,结合形态生理特征和16S r DNA基因序列同源性比对分析对菌株进行了分类,并测定了所分离的菌株对4种玉米病原菌的拮抗作用。[结果]从桂单0810、迪卡008、正大619这3个玉米品种苗期和穗期的根、茎、叶中共分离到82株内生细菌,归于4个属,芽孢杆菌属为优势菌群,各菌群在不同生育期及组织的分布动态各有特点,其中有8株菌对4种玉米病原菌表现出不同程度的拮抗作用。[结论]玉米内生细菌的多样性丰富,可作为玉米病害生防菌的来源。     

玉米内生固氮菌的分离鉴定及对小麦幼苗的促生效应

应用研磨法从健康玉米植株的根茎叶中分离到4株具有高固氮酶活性的内生菌,根据它们在植物组织来源和分离时稀释度的不同将其分别命名为L1A1、L1A4、L1B9和L2A2(L代表来源于叶片,A代表10倍稀释,B代表100倍稀释).经形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析,对4株菌鉴定结果表明,L1A1为约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、L1A4为Sphingomonas panni、L1B9为Sphingomonas yabuuchiae、L2A2为巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri).这4株菌均具有不同程度的固氮酶活性和产IAA(吲哚乙酸)能力,其中L1A1、L2A2具有降解有机磷能力,L1A4具有体外拮抗小麦赤霉病菌的能力.接种这4株菌的小麦苗高、根长、鲜质量、干质量和叶绿素含量均比未接菌小麦高(P＜0.05),说明其具有促进小麦幼苗生长的作用.     

不同生长条件下铁皮石斛内生细菌多样性及活性菌株的筛选

目的 比较和分析野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生细菌分布特点,筛选有较强定殖能力的活性菌株,为促进野生铁皮石斛驯化、提高药材品质奠定基础。方法 采用组织块分离法分离铁皮石斛根、茎、叶各部位的内生细菌,利用16S rDNA序列和系统发育树对分离菌株进行分析鉴定,体外筛选具有解磷、解钾、固氮、产铁载体、产IAA、拮抗病原菌的促生活性菌株,回接后再分离,观察内生细菌在组培苗中的定殖动态。结果 从铁皮石斛中分离到285株内生细菌,其中,217株分离自野生铁皮石斛,归类于3门9属,以芽孢杆菌属Bacillus和不动杆菌属Acinetobacter为优势菌群存在于根、茎、叶中,其菌株数分别占总分离菌株数的79.26%和8.76%;68株内生细菌分离自人工栽培铁皮石斛,归类于1门3属,以伯克霍尔德菌属Burkholderia和埃希菌属Escherichia为优势菌群存在于根、茎中,其菌株数分别占总分离菌株数的54.41%和30.88%。泛菌属Pantoea在野生和人工栽培铁皮石斛中均有分布。野生铁皮石斛内生细菌的物种数(9)和多样性指数(0.85)明显高于人工栽培铁皮石斛(物种数为3,多样性指数为0.61)。活性筛选共获得38株菌株,占筛选菌株的45%,4株野生铁皮石斛的活性内生细菌中有3株在人工组培苗具有较好的定殖性。结论 野生与人工栽培铁皮石斛内生细菌的类群结构和生物多样性具有明显差异,铁皮石斛内生细菌蕴含丰富的促生潜力。     

棉花内生细菌的分离及生防益菌的筛选

对不同品种和不同种植地区的健康棉花植株组织中内生细菌进行分离,共得到102个菌株.经鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、黄单孢菌属(Xanthomonas sp.)、假单孢菌属(Pseudomonas sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)及短小杆菌属(Curtobacterium sp.),其中芽孢杆菌的分离频率最高,为优势种群.对内生细菌数量测定表明,棉花种子、根、茎、叶柄、叶片等组织内均存在大量的内生细菌.不同品种、组织及种植地,内生细菌的数量不同.各组织中内生细菌的种群密度的分布特点是种子中最多,其次为根,再次为茎,叶片、花蕾,叶柄中最少.从87个棉花内生菌的分离菌株中筛选出对棉花枯萎病菌有体外拮抗活性的菌株22个,占菌株总数的25;;15株对立枯丝核菌有抑制作用,占菌株总数的17;.15株对两种病原菌都有抑菌作用,其中有些菌株表现出较强抑菌活性,具有作为生防菌的潜能.     

杜仲内生细菌对植物病原菌的拮抗作用

为进一步丰富玉米病害的生防资源,通过平板稀释法,对健康杜仲组织进行内生细菌的分离纯化,共得到内生细菌55株, 55株内生细菌分别属于芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）、贪铜菌属(Cupriavidus)和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）等5个属。利用平板对峙方法,筛选出对玉米小斑病和玉米茎基腐均有较好的抑制作用的内生细菌DZSY21,其抑菌率分别达到61.30%和79.10%,显微观察显示,拮抗菌株 DZSY21可引起病原菌菌丝断裂、畸形等现象。随后,对内生细菌DZSY21开展了gyrB及趋化性研究,结果表明,DZSY21为枯草芽孢杆菌,且对玉米根系分泌物具有较好的趋化性。