上海兽医所发现p53基因具有抵抗细菌感染作用

正近日,从中国农业科学院上海兽医研究所获悉,猪呼吸道传染病创新团队研究发现肿瘤抑制因子p53具有抵抗单增李斯特菌感染作用,并阐明了其调控宿主免疫反应帮助宿主逃避细菌感染的作用机制。肿瘤抑制因子p53参与机体的先天性免疫和获得性免疫应答,从而发挥抗病毒感染作用。此项研究成果阐明p53通过转录调控宿主的先天性免疫反应发挥抗单增李斯特菌感染的作用机制,开辟了p53抗细菌感     

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。     

黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素的作用

为了研究黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素(LLO)溶血活性及单增李斯特菌致病力的影响,试验采用测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、分析溶血活性、蛋白免疫印迹分析和细胞毒性试验的方法分析了黄芩提取物对单增李斯特菌增殖、单增李斯特菌溶血素溶血活性和单增李斯特菌对细胞的毒性作用。结果表明:黄芩提取物可通过直接中和单增李斯特菌溶血素活性而降低溶血活性,且这一作用与黄芩提取物的抗菌活性无关;在细菌与细胞共培养体系内加入黄芩提取物可有效抑制细菌对细胞介导的细胞毒性作用。说明黄芩提取物是一种潜在的抗单增李斯特菌感染的先导化合物。     

肉类及其制品中单增李斯特氏菌的控制方法

单增李斯特氏菌在自然界广泛分布,是一种能感染人类的致死率较高的食源性致病菌。肉制品的保存关键问题之一是解决单增李斯特氏菌的生长,研究开发高效、低毒并对单增李斯特氏菌有明显抑制作用的新型防腐剂显得尤为重要。本研究从天然香料、化学抑制和微生物抗菌三个方面介绍控制单增李斯特氏菌的方法。     

使用二重PCR方法快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

阿洛糖对非利用型单核增生李斯特菌生长影响的研究

为研究单核增生李斯特菌ICDC-LM188对阿洛糖的利用及阿洛糖对该菌株基因表达的影响,本研究利用含有不同碳源的MWB培养基和LB培养基分别进行单核增生李斯特菌在阿洛糖作用下的生长试验,采用RNA测序并进行主要差异表达基因分析。生长试验结果显示阿洛糖可以抑制ICDC-LM188生长。差异表达基因分析结果显示,5个上调表达基因均与已知的阿洛糖代谢相关,14个下调表达基因中部分与丙酮酸代谢相关,而丙酮酸代谢的抑制会影响菌体生长,推断丙酮酸代谢的抑制可能是阿洛糖抑制部分单核增生李斯特菌生长的原因。本研究为优化LAEB培养基提供了方向及对单增李斯特菌的糖代谢相关研究有借鉴意义。     

单核细胞增生李斯特菌SigB调控GadD3的抗酸应激作用

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)是一种重要的食源性人兽共患病病原菌,其拥有一系列抗酸应激系统以抵抗酸应激的伤害作用。谷氨酸脱羧酶(GAD)系统是该菌抗酸应激系统重要成员之一,酸应激存活试验表明,GAD系统3个谷氨酸脱羧酶基因对单增李斯特菌抗酸应激能力的贡献依次为gadD2、gadD3和gadD1。为阐明GAD系统抗酸作用调控机制,通过荧光定量PCR、GFP报告基因和免疫印迹结合酸应激存活试验,证实了应激调控因子SigB参与正调控gadD3的转录与表达,但是不影响gadD1和gadD2的表达,进而通过gadD3参与单增李斯特菌的抗酸应激作用。研究结果丰富了单增李斯特菌抗酸应激系统的调控网络,并可为李斯特菌病的防控提供理论依据。     

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。     

巨噬细胞通过产生胞外陷阱捕获并杀伤单增性李斯特菌

为了研究产单核细胞增生性李斯特菌(Lm)能否引起巨噬细胞产生胞外陷阱,并初步探讨巨噬细胞胞外陷阱(METs)对其杀伤作用。本文通过荧光显微镜、菌落计数和免疫印记等技术分析单增李斯特菌侵袭的2种巨噬细胞胞外陷阱形态、产量及抑菌效果。结果显示,小鼠巨噬细胞系RAW 264.7以及人巨噬细胞系Thp-1均可在单增李斯特菌的诱导下产生胞外陷阱;Lm在侵袭巨噬细胞15min后已有METs产生,1~3h产量明显增大,然后随时间的推移逐渐减弱;METs可以有效抑制Lm的生长。另外,本试验还发现Lm诱导胞外陷阱的产生与细胞外信号调节激酶相关。     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

单增李斯特菌Lm4b＿02324基因缺失株的构建及生物特性研究

【目的】研究Lm4b＿02324基因编码的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶对单增李斯特菌生物学特性的影响,为研究单增李斯特菌的致病机制奠定基础。【方法】本研究使用重叠延伸PCR技术,并通过连续传代来构建稳定遗传野生型单增李斯特菌Lm928株的Lm4b＿02324基因缺失株(Lm928Δm4b＿02324)与Lm4b＿02324基因回补株(CLm928Δm4b＿02324)。通过检测不同培养时间的D_{600 nm}值并绘制生长曲线分析Lm928、Lm928ΔLm4b＿02324和CLm928ΔLm4b＿02324 3株菌的生长特性;对小鼠腹腔注射不同浓度的3株菌,观察感染后临床症状,统计死亡率,通过寇氏法计算3株菌对小鼠的半数致死量(LD₅₀);将Lm928、Lm928ΔLm4b＿02324和CLm928ΔLm4b＿02324以感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10分别感染HCMEC细胞,通过检测感染后不同时间细胞内的细菌数量分析各菌株的黏附与侵袭能力和胞内生存能力;提取野生株与缺失株DNA,使用prfA、mpl、h...     

四甲基吡嗪对獭兔单增李斯特菌感染和天然免疫的影响

本试验通过研究四甲基吡嗪(TMP)对单增李斯特菌感染獭兔载菌量、溶血素、促炎因子(TNF-α、IL-1β和IFN-γ)、免疫器官指数和天然抗体的影响,旨在探讨TMP对单增李斯特菌的抑菌作用。选择断奶獭兔180只随机分为5组,每组6个重复,每个重复6只。对照组饲喂基础日粮,其他4组在基础日粮中分别添加0、50、100、150 mg/kg TMP。饲养试验第1天,4个试验组獭兔每只灌服1 mL(10~7 CFU)单增李斯特菌株,对照组灌服无菌株的培养液,饲养试验持续14 d。结果表明,TMP降低了獭兔肝脏、脾脏和淋巴结的单增李斯特菌载菌量(P0.05)。盲肠食糜、肝脏、脾脏和淋巴结载菌量均呈线性下降(P0.05)。添加TMP使獭兔李斯特菌溶血素和促炎因子(TNF-α和IL-1β)显著降低(P0.05),14 d时,李斯特菌溶血素呈线性下降(P0.05),促炎因子(TNF-α和IL-1β)均呈现线性和平方下降(P0.05)。胸腺指数、脾脏指数、血清IgA和IgG在单增李斯特菌感染后下降,随TMP添加量增加而增加,但只有饲喂至7 d时的脾脏指数呈线性上升(P0.05)。说明日粮中添加TMP可以降低单增李斯特菌感染獭兔组织载菌量,减少单增李斯特菌的毒力,对提升免疫器官指数和天然抗体有积极作用。     

单增李斯特菌内化素基因inlG基因原核表达及小鼠免疫保护性分析

为研究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)内化素基因inlG编码蛋白的免疫原性和免疫保护效果,以标准株ATCC19111菌株基因组为模板,参照GenBank上inlG基因序列设计特异性引物,运用PCR方法扩增inlG基因,构建重组质粒pET-28a(+)-InlG,将其转化至表达菌BL21(DE3),加IPTG后优化表达条件进行SDS-PAGE分析,Western blot分析抗原性。接着将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后皮下注射小鼠,免疫后测定效价,以单增李斯特菌进行攻毒试验,统计小鼠存活率来研究对小鼠的免疫保护效果。结果:扩增出inlG基因全长约为1 473 bp,inlG基因编码490个氨基酸;成功构建重组质粒且表达出相对分子质量约70 ku的蛋白,目的蛋白在上清中表达量较好;Western blot结果表明InlG蛋白具有良好的反应原性;重组蛋白免疫小鼠后小鼠效价达到1∶52 000以上,具有良好的免疫原性;用2倍半数致死量的LM菌液腹腔感染小鼠,免疫蛋白组小鼠死亡一半,小鼠存活率远远高于未免疫组(6.25%),表明InlG蛋白对小鼠具有较好的免疫保护性。本研究为进一步探讨inlG基因生物学功能奠定基础。     

豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的检测

为分析来自豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的分布变化,本研究以分离自豫西地区市售鸭翅的11株单增李斯特菌分离株为研究对象,利用PCR方法进行8种毒力基因的检测(inlA、inlB、virR、mprF、dltA、dltB、dltC、dltD基因)。结果显示有3株出现了基因缺失,dltA基因检出率为90.9%(10/11),dltC、mprF基因检出率均为81.8%(9/11),其他基因全部呈阳性。这些毒力基因在单增李斯特菌分离株中分布广泛,对豫西地区市售鸭翅具有潜在的威胁,应引起食品监管部门的高度关注。     

单增李斯特标准菌NrdD基因插入突变株的构建

利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉鸡的治疗效果及机制

本试验研究了植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉仔鸡的生产性能、氧化反应及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响,旨在探讨植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉鸡的治疗效果及机制。选择1日龄AA公雏480只,随机分为4组,每组6个重复,每个重复20只鸡。对照组和感染组饲喂基础日粮,抗生素组、乳杆菌培养物组在基础日粮中分别添加40 mg/kg盐酸恩诺沙星和1.6 g/kg灭活植物乳杆菌培养物。5日龄时,感染组、抗生素组和乳杆菌培养物组每只鸡灌服1 mL(10~5 CFU)单增李斯特菌感染液,对照组灌服无菌株培养液,全程试验期28 d。结果显示,与感染组相比,植物乳杆菌培养物可以显著提高7和28 d肉仔鸡平均日增重、平均日采食量和始末体重(P0.05),显著降低肉仔鸡料重比(P0.05);显著降低14和28 d肉仔鸡血清和十二指肠黏膜中的二胺氧化酶、丙二醛、蛋白羰基(除14 d十二指肠黏膜外)的含量(P0.05);显著降低7和28 d肉仔鸡MAPK3、MAPK10和DUSP6(7 d除外)基因mRNA表达水平(P0.05)。综上,日粮中添加植物乳杆菌发酵培养物可以提高肉鸡抗氧化性,抑制单增李斯特菌的感染,提高抗菌能力,通过MAPK信号提高抗炎能力。植物乳杆菌发酵培养物对单增李斯特菌感染肉鸡有较好的治疗效果,可以作为替代抗生素的添加剂。     

单增李斯特菌耐药基因tetM、ermB接合转移

为探讨食品源单增李斯特菌四环素耐药基因tetM和红霉素耐药基因ermB是否能向粪肠球菌水平传播,选择2株耐受四环素(tetM)和1株耐受红霉素(ermB)的单增李斯特菌为供体,1株耐受卡那霉素的粪肠球菌为受体菌进行滤膜接合试验。对接合子tetM和ermB基因及相关的转座子Tn196、Tn197进行PCR检测。结果显示,分别获得17,23株耐四环素接合子,28株耐红霉素接合子,接合转移率分别为3.4×10~(-7),4.6×10~(-7),5.6×10~(-7)。接合子均产生了与供体菌一致的四环素和红霉素耐药表型,并且PCR扩增到相应的tetM和ermB基因,其序列与供体单增李斯特菌的耐药基因序列一致,但未扩增到相应的转座子基因;证实单增李斯特菌四环素耐药基因tetM及红霉素耐药基因ermB可以向粪肠球菌水平传播并发挥耐药作用。     

寡肽转运蛋白lmo2193基因缺失对单增李斯特菌环境适应性的影响

研究通过比较三株单增李斯特菌在不同环境下的适应性,探究lmo2193基因对单增李斯特菌环境应激的影响。测定不同温度、EtOH浓度、pH、NaCl浓度条件下的生长趋势,绘制生长曲线。结果显示,缺失株的生长速度明显较野毒株、回补株生长缓慢,缺失株对42℃和4.5%无水乙醇(EtOH)胁迫条件下的耐受性明显低于野毒株、回补株。表明LM90SB2菌株lmo2193基因的缺失会降低其对环境的适应性,为进一步探究寡肽转运蛋白在单增李斯特菌中的作用奠定了基础。