猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

芸薹属植物非编码RNA BcMF11基因同源序列的克隆及进化分析

芸薹属植物资源丰富,具有重要的经济价值,但其亲缘进化关系较复杂.非编码RNA是一类在生物体内广泛存在的,没有明确的开放阅读框,但能够在生活活动中行使多种调节功能的特殊基因(Storz,2002).     

向日葵肌动蛋白基因的cDNA克隆及进化分析

本研究以向日葵（Helianthus annuus)为材料，提取其总RNA，根据植物肌动蛋白基因编码区的5′和3′末端设计简并引物，利用RT-PCR技术，用5′RACE试剂盒扩增出向日葵肌动蛋白基因编码区全长，以豌豆肌动蛋白cDNA作探针的Southern杂交检测表明扩增出了肌动蛋白基因，将所获片段克隆到pGEM-T载体后进行测序，所得序列与GenBank已知肌动蛋白基因序列的相似性均在60%以上，其中与之相似性最高的锦葵为85%；与主要高等植物肌动蛋白氨基酸序列的相似性达80%以上，根据氨基酸序殖的相似性绘制主要高等植物肌动蛋白的系统树（种系树），表明向日葵肌动蛋白与锦葵肌动蛋白可能由同一祖先进化而来。     

苹果属小金海棠Fe(Ⅱ)转运蛋白基因的克隆和序列分析

1986年,Romheld和Marschner首先提出高等植物在长期适应缺铁胁迫过程中逐渐形成的两种适应性机理。在缺铁胁迫的条件下,机理I植物通过激活一种特异的H^ -ATPase而使土壤酸化,并通过一种特异的根部还原酶将Fe(Ⅲ)还原成Fe(Ⅱ)。之后Fe(Ⅱ)通过它的转运蛋白(Transporter)跨越根部的细胞质膜而被转运。     

小白鼠乳铁蛋白基因cDNA克隆及序列分析

乳铁蛋白(LF)是哺乳动物母乳中含量丰富的一种天然铁结合蛋白，广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中。许多研究表明，LF可以抵御细菌病毒的侵染并调节机体免疫功能，成为母畜乳腺和仔畜胃肠道的一种防御屏障；能够促进肠道细胞对铁离子的吸收和利用；另外还有关于LF可以抗氧化和促进肠道有益菌群生长的报道。     

猪Fas基因的克隆及序列分析

从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪F as基因,将其克隆到PM D 18-T载体上,进行序列分析。结果表明,克隆的猪F as基因序列与G enB ank上登录的猪F as基因同源性为100%,与人、牛、羊的F as基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73.4%、79.2%、76.4%和56.2%、67.0%、64.6%。F as蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、人、牛和羊的F as基因中呈现较高的同源性。     

鸭瘟病毒UL28基因的克隆、鉴定及序列分析

对已构建的鸭瘟病毒（DPV）DNA基因文库重组质粒序列测序后,结合ORF Finder和BLAST工具分析得到了DPVUL28基因的开放阅读框。PCR扩增后将其连接至pMD18-T克隆载体,获得完整基因。经测序、PCR和双酶切鉴定,进一步用核酸探针斑点杂交确认完整片段（ORF2412）属于DPVDNA（GenBank登录号EF643557）。运用生物信息学分析软件NNPPversion2.2、Translate tool、DNAStar等分析序列特性,并用EMBOSS软件包的CHIPS和CUSP程序分析密码子使用情况。结果显示,其具有疱疹病毒_UL28类似家族成员的典型特征,包含1个保守结构域：疱疹病毒加工和组装蛋白（PRTP）,并含有多个与功能相关的磷酸化和N-糖基化位点,编码多肽疏水区大于亲水区,是一种膜外蛋白。DPVUL28基因与禽类疱疹病毒（α-疱疹病毒）的亲缘关系最近。UL28基因在密码子选择使用上显示出较强的偏爱性。     

家蚕多聚泛素基因的电子克隆、序列分析及表达谱预测

具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB（GenBank登录号：AADK01019318）,并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%～100.0%和0.000～0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性（Hd=0.962）、平均核苷酸差异数（K=7.495）、核苷酸多样性（Pi=0.03287）、密码子有效值（ENC=41.623〈61）、偏爱指标（CBI=0.496〉0）和χ2检验计算（χ2=0.713）显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。     

基于Cytb基因的九种多刺蚁(膜翅目:蚁科)的分子系统学

为了提供我国多刺蚁属(Polyrhachis)昆虫的分子系统学资料,我们对9种多刺蚁的mtDNA的Cytb部分序列进行测定和分析。在所得465个位点的序列中,变异位点152个,占32.7%,碱基T、C、A和G的平均含量分别为42.0%、19.6%、29.2%和9.2%,A+T平均含量71.2%。在氨基酸组成上,共编码155个氨基酸。碱基替换主要发生在密码子第三位点,转换频率大于颠换频率,转换主要发生在T与C之间,颠换主要发生在T与A。以弓背蚁属(Camponotus)的黄斑弓背蚁(C. albosparsus)和浅毛弓背蚁(C.albivillosus)为外群,用NJ、MP及贝叶斯推论法构建系统发育树。本研究结果与经典分类结果相符:在9种多刺蚁中,Myrmhopla亚属的双齿多刺蚁(P. dives)独立成为一支,分化较早,位于系统进化树的最底部,最早分化出来;而Myrma亚属的亚毛多刺蚁(P. subpilosa)、梅氏多刺蚁(P. illaudata)、警觉多刺蚁(P. vigilans)以及拟梅氏多刺蚁(P.proxima)聚合成一支,位于系统进化树的最顶端,它们的亲缘关系相近,属于较进化的类群。但是Polyrhachis亚属的叶形多刺蚁(P. lamellidens)和Cyrtomyrma亚属的结多刺蚁(P. rastellata)的进化关系仍需要进一步探讨。     

烟草24kD PR蛋白基因的克隆及序列分析

烟草２４ｋＤＰＲ蛋白裂解晚疫病菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）孢子囊并抑制其菌丝生长，是马铃薯晚疫遗传工程所需要的核心元件，我们以烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＸａｎｘｉ－ｎｃＮＮ）基因组ＤＮＡ为模板，通过事成５′－端及３′－端的一对特异引物，利用多聚酶锭反应（ＰＣＲ）扩增到得缺失３′－端ＣＴＰＰ的２４ｋＤ蛋白基因，并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒上，序列分析表明，我们得到的２４ｋ     

水貂杯状病毒的分离与鉴定

2007年6月,大连地区某水貂(Mustela vison)养殖场发生传染病一例,临床表现为眼分泌物增多,鼻镜干燥等症状,个别病例有死亡发生,采集发病水貂眼、鼻拭子和各组织脏器,通过细胞连续传代培养,分离到病毒1株,理化鉴定结果表明,该病毒对氯仿、乙醚和去氧胆酸钠有抵抗力;能耐受pH 3.0的酸性环境;50oc水浴1 h病毒不丧失感染能力;胰酶耐受性试验不敏感;病毒形态学观察,直径30～35 nm,无囊膜;核酸型鉴定为RNA病毒;核酸序列分析表明该片段与GenBank上收录的美国1980年分离到的水貂杯状病毒AF338405、AF338406和AF338407核甘酸及氨基酸序列的同源性最高,分别为99.3%～99.5%和95.4%～100%,最终鉴定为水貂杯状病毒(mink calicivirus,MCV).水貂杯状病毒在我国的分离尚属首次报道.     

绵羊甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因的克隆及序列分析

甘露聚糖结合凝集素(MBL),又称甘露聚糖结合蛋白(mannan/mannose-binding protein,MBP),是C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员.目前,关于MBL的研究在人、小鼠和大鼠上已经相当详尽,在牛、猪、马、弥猴、黑猩猩、狒狒、兔和鸡上也有一定的研究,除鸡外,其余的都已发现2种MBL:MBL-A(血清型)和MBL-C(肝型),但在绵羊上仍为空白.本实验以绵羊的基因组DNA为模板,借助人、牛MBL的保守序列来获得绵羊MBL基因片段.     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。     

山羊IL-2基因cDNA的克隆、鉴定及序列分析

根据GenBank发表的山羊（Capra hircus)IL-2基因序列，设计了一对引物。以ConA刺激的外周血淋巴细胞为材料用RT－PCR的方法。从总RNA中扩增出山羊IL－2基因。琼脂糖电泳显示扩增片段约为500bp。分离纯化片段，克隆入表达质粒pBV220，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的山羊IL－2基因与GenBank上发表的序列一致。该序列与绵羊（Ovis aries)和牛(Bas taurus)的IL－2基因序列同源性最大，在96％以上，氨基酸和抗原性比较分析认为，山羊IL－2与绵羊及牛的IL－2在这两方面有较大的同源性。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素基因(MBL)全长DNA序列克隆及生物信息学分析

绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)是肌体天然免疫系统的重要组成部分。根据人(Homo sapiens)和牛(Bos taurus)的MBL基因序列的同源保守区域,分段设计9对特异性引物,以中国美利奴羊(Ovis aries)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序、拼接,首次克隆到长为4462bp的绵羊MBL基因组DNA序列,包括了该基因的启动子区、4个外显子和3个内含子,编码249个氨基酸;BLAST分析其与牛MBL-C编码的氨基酸同源性最高为96.39%,判定其为MBL-C型基因,并将该序列提交至GenBank(Accession No.FJ977629);通过Expasy网站预测其蛋白结构功能特征,1～19氨基酸为绵羊MBL基因信号肽区域,外显子1编码N-端富含胱氨酸区和8个Gly-X-Y重复序列的胶原样区,外显子2含有12个Gly-X-Y的胶原样区,外显子4编码的碳水化合物识别域(CRD)具有C型凝集素CRD的共同特征。本研究为国内首次报道绵羊MBL基因比较完整基因组DNA序列,为深入研究MBL的结构与功能以及MBL缺损的分子机制提供基础数据。     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...