Cry类和Vip3Aa类Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力和增效作用

筛选对靶标害虫高效的Bt杀虫蛋白、评价蛋白组合对靶标害虫的杀虫作用,对于转基因抗虫新品种的研发具有重要的指导意义。本文采用人工饲料混合法评价了Cry1Ab、Cry1Fa、Cry1Ca、Cry1Ba、Cry2Aa、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19共8种Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的毒力;同时评估了Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合蛋白对亚洲玉米螟的杀虫作用,筛选出毒力最佳的组合比例。结果表明：Cry1Ab、Cry1Fa、Cry2Aa对亚洲玉米螟的LC₅₀在0.24～0.72μg/g之间,其中Cry1Ab的毒力最强,显著高于Cry1Fa和Cry2Aa蛋白,Cry1Fa与Cry2Aa毒力无显著性差异。Cry1Ca、Cry1Ba、Vip3Aa11、Vip3Aa20、Vip3Aa19对亚洲玉米螟的LC₅₀均大于50μg/g。当Cry1Ab/Vip3Aa19、Cry1Fa/Vip3Aa19混合比例为1∶1时,增效作用最强,增效因子分别为3.18和1.58。本研究结果为多价转基因玉米的研发提供了重要依据。     

Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的最小活性区研究

为了确定Cry9Aa3蛋白对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和小菜蛾(Plutella xylostella)的最小活性区,根据NCBI BLAST比对结果与SWISS-MODEL同源建模结果,设计了12对截短引物,以cry9Aa3全长序列为模板,扩增出了12种不同截短片段,与pEB载体重组后的阳性克隆,转入大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Rosetta(DE3)诱导表达,提取蛋白。对小菜蛾和亚洲玉米螟的生物学活性测定,发现截短蛋白Cry9Aa3-45~700、Cry9Aa3-1~654,对小菜蛾和亚洲玉米螟有较高的活性,其中截短蛋白Cry9Aa3-45~700对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为5.27、7.56μg/g,截短蛋白Cry9Aa3-1~654对小菜蛾和亚洲玉米螟的LC50分别为7.76、7.79μg/g,与阳性对照无显著差异,而截短蛋白Cry9Aa3-1~653和Cry9Aa3-46~700(LC50200μg/g)对幼虫几乎丧失生物学活性。这说明Cry9Aa3蛋白对小菜蛾和亚洲玉米螟的杀虫活性区相同,最小活性区位于45I和654P之间。     

Beetle-specific Bacillus thuringiensis Cry3Aa toxin reduces larval growth and curbs reproduction in Spodoptera littoralis (Boisd.)

Application of Bacillus thuringiensis tenebrionis (Bt) and expression of the Bt protein Cry3Aa in genetically modified crops are used for targeted control of the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata (Say). The Cry3A proteins are selectively toxic for the beetles but the present study describes effects of Cry3Aa on the Egyptian armyworm, Spodoptera littoralis (Boisduval). Cry3Aa expressed in potatoes or added to an agar-base wheat-germ diet reduced the growth of S. littoralis caterpillars and the fertility of adults. The effect of 1.4 mg kg(-1) Cry3Aa in potato leaves was comparable with that of 3.3 mg kg(-1) in the diet. This difference in activity was correlated with better digestibility and higher conversion efficiency of the diet that also supported higher reproduction rate: S. littoralis grown on the potatoes reached a similar size to those on the diet but laid only 702 instead of 1077 eggs per female. Cry3Aa consumption reduced body growth as a consequence of lower food intake without significantly affecting food digestibility and the conversion efficiency of nutrients. The 11% and 5% body weight reductions caused by 1.4 mg kg(-1) Cry3Aa in potatoes and 3.3 mg kg(-1) in the diet, respectively, were associated with 74% and 65% reduction in the number of progeny; S littoralis grown on a diet with 9.1 mg kg(-1) Cry3Aa were 10% smaller and produced no viable progeny. These data suggest that the curtailment of reproduction was not caused by a general shortage of nutrient reserves but by a more direct Cry3Aa effect on the reproduction process.     

Efficacy of Bacillus thuringiensis Cry3Aa protoxin and protease inhibitors against coleopteran storage pests

BACKGROUND: Environmental impacts and resistance to insecticides pose serious challenges to stored‐product insect and other types of pest control. Insect‐resistant transgenic grain is a potential alternative to fumigants, but candidate control proteins are needed, especially for coleopterans. Therefore, we evaluated the efficacy of a coleopteran‐active toxin, Bacillus thuringiensis Cry3Aa, with or without protease inhibitors, in laboratory feeding assays against coleopteran storage pests. RESULTS: In a comparison of the toxicity of Cry3Aa protoxin towards three species of coleopteran storage pests, Tenebrio molitor L. was found to be most sensitive, Tribolium castaneum (Herbst.) was most refractory and Rhyzopertha dominica F. displayed an intermediate response. For R. dominica, Cry3Aa combined with 3500 mg potato carboxypeptidase inhibitor or 5000 mg aprotinin kg^?1 diet resulted in both delayed development and increased mortality. Potato carboxypeptidase inhibitor and bovine aprotinin reduced the LC₅₀ of Cry3Aa for R. dominica two‐ and threefold respectively. Cry3Aa treatment resulted in fewer progeny from R. dominica, and progeny was further reduced when the protoxin was combined with potato carboxypeptidase inhibitor. CONCLUSIONS: These data support the hypothesis that a combination of Cry3Aa protoxin and protease inhibitors, particularly a potato carboxypeptidase inhibitor, may have applications in control strategies for preventing damage to stored products and grains by coleopteran pests. Published 2011 by John Wiley & Sons, Ltd.     

苏云金芽孢杆菌Cry8Ca2蛋白的纯化与活性的研究

cry8 Ca2基因是本实验室自行分离克隆的一种新型苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白基因,其表达130 kDa蛋白对铜绿异丽金龟(Anomala corpulenta)和黄褐异丽金龟(A.exoleta)幼虫具有较高的活性。本研究对Cry8Ca2蛋白原毒素及胰凝乳蛋白酶消化片断的纯化条件及活性进行研究,最适的消化条件为质量比1∶20,37℃,消化1 h。通过阴离子交换层析得到纯的活性毒素蛋白。用原毒素与纯化的毒素对铜绿丽金龟幼虫进行生测,Cry8Ca2原毒素蛋白的LC₅₀为0.47μg/g土,纯化的毒素的LC50为0.08μg/g土,毒素的杀虫活性可以达到原毒素的6倍。     

青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的能力

本文评估了Cry1Ab、Cry1Ba和Cry1Ca蛋白对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力,其LC50分别为0.442 5、0.675 7 μg/cm2和0.150 2 μg/cm2,Cry1Ba毒力最低,其次是Cry1Ab,而Cry1Ca毒力最高。青霉素影响幼虫对晶体毒素的耐受能力;一次添加高剂量(500 μg/cm2)青霉素于饲料中显著提高幼虫的耐受能力,以含低剂量(60 μg/cm2)青霉素的饲料饲养幼虫多代也能达到相似的效果。     

苏云金杆菌Bt-59菌株Cry/Cyt毒素蛋白鉴定及杀虫活性

苏云金杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis,Bti）是防治蚊幼虫的重要病原细菌,不同菌株间毒素蛋白种类和分布不尽相同。本研究利用苏云金杆菌以色列亚种Bt-59菌株的全基因组数据,对潜在的毒素基因种类、分布及菌株杀虫活性进行了分析。结果表明,Bt-59菌株除了含有Bti标准菌株主要毒素基因外,还含有Cry4-like基因,且Cry10Aa和Cyt1Ca基因在质粒4上发生了易位。质粒5上的Cry60Aa和Cry60Ba基因编码的毒素蛋白含有ETX_MTX2结构域,并与苏云金杆菌jegathesan亚种的同源蛋白一致性为100%。Cyt1Ca蛋白除了含有Bac_thur_toxin结构域外,还含有2个串联的RicinB_lectin_2结构域。菌株Bt-59对蚊幼虫具有较高的杀虫活性,对白纹伊蚊Aedes albopictus和淡色库蚊Culex pipiens pallens的LC₅₀分别为1.239 μL/L和0.341 μL/L。研究结果明确了菌株Bt-59毒素蛋白的种类和特征,为菌株遗传改良提供理论基础。     

Cry1Ba3、Cry1Ia8蛋白对Cry1Ac抗性小菜蛾的杀虫活性研究

利用2种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对2种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg/mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。2种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这2种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。     

基于比较基因组学分析苏云金芽胞杆菌防治蛴螬的相关功能基因

为挖掘对地下害虫蛴螬高效的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）菌株在杀虫及环境适应方面的关键功能基因,本研究对蛴螬高效的菌株261-1、Fcd114、1126-1、HBF-18和78-2以及对鳞翅目害虫高效菌株WBt-2、G03进行了基因组测序,并与对鳞翅目害虫高效菌株HD1、HD12、HD73和对蛴螬高毒力菌株Bt185等基因组进行了比较分析,重点分析比较了杀虫基因、多糖代谢相关基因、与其他微生物竞争和适应性相关的酰基高丝氨酸内酯水解酶（N-Acylhomoserine lactones hydrolase,aiiA）、突破和克服靶标昆虫免疫系统的免疫抑制因子A（Immune Inhibitor A,InhA）、具有抗病并能增效杀虫的双效菌素（Zwittermicin A,ZwA）等五大类基因和基因簇。研究发现,这些菌株按照其所含有的杀虫基因特异性可分为3个类型：对鳞翅目害虫有效的菌株（类型1）、对鞘翅目害虫有效的菌株（类型2）以及同时含有两种害虫有效基因的菌株（类型3）。对地下害虫蛴螬特异（类型2）的Bt菌株除了在杀虫基因上具有特异性之外,所含有的aiiA、InhA基因也有显著特点。相关研究为进一步对地下害虫蛴螬高效Bt菌株的改良提供了新思路。     

对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析

为筛选对黏虫[Mythimna separata(Walker)]具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白,本研究提取Cry1类、Cry2类、Cry9类及Vip3A类等11种蛋白,通过人工饲料喂毒方法对黏虫进行生物活性测定。结果表明,Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白对黏虫具有杀虫活性,其致死中浓度依次为5.09、17.71、26.75、27.42及43.93μg/g;Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫生长具有抑制作用,其浓度为10μg/g时的体重抑制率分别为78.4%、79.0%、86.9%,浓度为100μg/g时的体重抑制率分别为92.8%、95.7%、96.7%;Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白对黏虫无显著活性。本研究为黏虫的生物防治奠定了基础,并为抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。     

对草地贪夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株筛选与杀虫活性研究

草地贪夜蛾是一种世界性重大农业害虫,给玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重危害.为实现对草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控,亟需筛选高毒力苏云金芽胞杆菌菌株资源.本研究以前期实验室储备的对斜纹夜蛾、小地老虎具有杀虫活性的363株野生菌株库为候选菌株,基于菌株杀虫基因差异及进化关系,去除冗余菌株后获得172株候选菌株.通过...     

两种蜘蛛毒素肽与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的融合表达及杀虫活性

蜘蛛毒液中含有多种杀虫肽,因而具有较强的杀虫作用,可迅速杀死农林害虫。蜘蛛毒素肽（ω-ACTX-Hv1a,ω-ACTX-Hv2a）是从澳大利亚的多能厚爪蛛Hadronyche versuta的毒液中分离获得,对昆虫有毒但对哺乳动物无毒。本文通过将人工合成的两种蜘蛛肽基因（hv1a、hv2a）与来源于对棉铃虫具有高活性的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）野生菌株NBIC380中的杀虫基因cry1Ac进行融合并在NBIC380中表达,获得了7种不同的重组菌株BtBM-Ve（含有空表达载体）、BtBM-Ac（含有cry1Ac基因）、BtBM-1a（含有hv1a基因）、BtBM-2a（含有hv2a基因）、BtA1a（含有cry1Ac+hv1a融合基因）、BtA2a（含有cry1Ac+hv2a融合基因）和BtA（1+2）a（含有cry1Ac+hv1a+hv2a融合基因）。重组菌分别进行了棉铃虫Helicoverpa armigera 2龄幼虫、秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans和朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus的生物活性测定,结果显示BtBM-Ve无杀虫增效作用,BtBM-Ac、BtBM-1a、BtBM-2a、BtA1a、BtA2a和BtA（1+2）a针对不同的虫源具有不同的杀虫增效活性,对3种害虫杀虫增效最多的重组菌是BtA（1+2）a,对棉铃虫2龄幼虫杀虫增效百分比为93.43%,对秀丽隐杆线虫为34.48%,对朱砂叶螨为13.46%。本文构建的基因工程菌对防治鳞翅目害虫、螨虫和线虫具有重要的理论意义和应用前景。     

对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

Bt棉有效控制了棉田主要害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera),然而原来处于次要地位的刺吸式口器害虫盲蝽(Heteroptera:Miridae)为害逐年加重,目前对绿盲蝽(Apolygus lucorum Meyer-Dür)有效的抗虫基因未见报道。本研究以本实验室保存的Bt杀虫基因和菌株为材料,对绿盲蝽进行杀虫活性筛选。利用本实验室先前克隆的Mtx类杀虫基因cry15Aa表达产物进行绿盲蝽杀虫活性测定,研究结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。通过杀虫活性测定,获得对绿盲蝽有效的Bt菌株20株;对这些菌株表达蛋白进行质谱鉴定,LC-MS/MS质谱鉴定结果显示,这些菌株可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ba、Cry1Be、Cry8Ha等十余种对鳞翅目、鞘翅目害虫有杀虫活性的蛋白片段,并且有4株Bt菌株样品中检出了Mtx类杀虫蛋白Cry15Aa的片段。但是进一步基因鉴定结果表明,这4株菌株并不含有cry15Aa全长基因,推测这些菌株中含有Cry15类的新基因。上述研究结果表明这些菌株中可能存在对盲蝽有效的新型杀虫蛋白。本研究在发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时,获得了对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt新菌株,对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。     

苏云金芽孢杆菌BtC008杀虫晶体蛋白基区鉴定、克隆及杀虫活性分析

苏云金芽孢杆菌BtC008对棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力。本文分析了其杀虫基因类型包括cry1Ab、cry1Ca、cry1Ia、crygAb和一种新的cry1类基因，SDS-PAGE分析其至少2种cry1类基因获得了表达，在分子水平说明了该菌株高毒力的原因。在此基础上克隆了1种cry1Ab类杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）基因，并被Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ab20。序列分析显示该基因所编码蛋白与已知的Cry1Ab13有1个氨基酸不同。将cry1Ab基因毒性片段（1．95kb）插入表达载体pET-21b，转化Escherichia coli Rosetta（DE3）菌株，表达的包涵体蛋白对小菜蛾和棉铃虫幼虫具有杀虫活性，LC60分别为100．74μg／mL和29．87μg/mL，进一步明确了Cry1Ab20蛋白的杀虫活性区。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性

为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源,本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因,并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因,全长3501 bp,编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列,与Cry1Db1的同源性最高,为86%,命名为Cry1Dd1（登录号为KJ728844）。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中,转入BT无晶体突变株HD73^-中进行表达。结果表明,cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达,并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD,与预测的大小相符。生物活性测定表明,Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性,LC₅₀为13.1 μg/mL;能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长;但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析,cry1Dd1包含8个block保守区域,这和目前其他的cry基因相似;Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37~593位氨基酸残基。