广西柳州猪瘟流行毒株E2基因的扩增及序列分析

为了了解猪瘟流行毒株间的差异,试验应用RT-PCR技术对1株广西柳州流行的猪瘟野毒的E2基因进行了扩增、克隆及测序,利用DNAStar分析软件将其与国内外参考毒株的抗原序列进行比对分析,并绘制了系统发育进化树.结果表明:柳州株的核苷酸序列及推导的氨基酸序列存在多处替换,与中国标准株Shimen和疫苗株HCLV核苷酸序列...     

猪瘟病毒云南毒株E2基因片段序列测定及分析

用RT－nPCR方法，选择猪瘟病毒2000年云南部分地方流行毒株E2基因主要保护性抗原决定簇编码区片段进行扩增和cDNA序列分析，并与中国标准强毒石门株进行比较。结果显示，云南地方毒株之间核苷酸及氨基酸序列同源性均大于90％；但与中国标准强毒石门株差异较大，其核苷酸及氨基酸同源性均小于80％。     

猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA，根据已报道的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT－PCR）、套组聚合酶链式反应（nPCR)及测序技术，对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNAstar软件比较分析了5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株（C－ST株）E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现，5株野毒与C－ST株核苷酸序列的同源性为81．7％－83．1％，氨基酸同源性为87．3％－88．6％，表明它们之间存在较大的差异；但5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达98．8％－99．3％，氨基酸同源性为96．6％－99．2％，表明它们之间的差异较小。     

广东省猪瘟流行野毒E2基因的扩增及其序列分析

运用RT-PCR技术对3株广东省近期流行的猪瘟野毒的E2基因进行了扩增,并进行核苷酸序列分析,同时与国内外参考毒株的抗原序列进行了比对分析,绘制系统发育进化树。结果表明,3株流行毒株E2基因间核苷酸序列的相似性为81.9%～90.9%,所推导氨基酸序列相似性为56.6%～77.4%;与石门株之间核苷酸序列的相似性为82.3%～93%,所推导氨基酸序列相似性为57%～84.5%。经系统发育关系分析,1株属于基因1群(group1),2株属于基因2群(group2),提示近期猪瘟流行毒株的变异呈现一定的多样性。     

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT－PCR和nPCR扩增由4株甘肃省近期（1997－1998）猪瘟流行野毒株的E2基因，将其克隆到pGEM-TEasy载体上，经转化、筛选、鉴定后，测定核苷核序列，4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为89．2％－99．7％，相应的氨基酸序列同源性为93．8％－99．0％，这4株流行毒株；与C－株（疫苗种毒）E2基因的核苷酸序列同源性为82．2％－84．3％，相应的氨基酸序列的同源性为87．9％－90．2％，表明近期猪猪瘟流行毒株与C－株的gp55蛋白之间存在一定的差异。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增,其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段.经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定,并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明,所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高,而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低,基因型差异比较明显,并不归属于同一个基因亚群.本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列和氨基酸序列分析,揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景.     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT-PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因，并将其克隆到pMD18-T载体；经转化、筛选、鉴定后，测定了核苷酸序列，根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行gp55氨基酸序列推导，并进行同源性比较。结果表明，该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为81．9％、83．4％和83．5％；相应地，gp55氨基酸同源性分别为94．8％、95．6％和95．3％。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb后获得了重组质粒pFBHT-E2，进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，发生转座作用；经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA，将其命名为rBacmid-E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。     

辽宁地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解近年来辽宁地区猪瘟流行毒株的遗传变异情况,本试验利用RT-PCR方法对2006年～2011年辽宁地区发病猪群中猪瘟病毒感染情况进行了检测并获得了20株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的扩增片段,测序后得到276 bp的E2基因编码序列;并在此基础上利用DNAStar和MegAlign等软件对所测定的20株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对.结果表明,20株猪瘟野毒株分别属于基因2.1、2.2亚型和1.1亚型,其中基因2.1亚型已经成为辽宁地区猪瘟病毒的优势流行毒株.属于基因2.1亚型的猪瘟野毒株与疫苗株之间的同源性在76.8％～80.5％之间,与经典强毒Shimen株的同源性在77.4％～81.1％之间.而病毒E2基因变异位点主要分布在所测序列的前30个氨基酸,与强毒Shimen株、疫苗株相比其变异率高达20％以上.说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性,并且多数毒株已向远离强毒Shimen株、疫苗株方向变异.     

不同批猪瘟活疫苗中猪瘟兔化弱毒E2基因主要抗原编码区序列分析

对12批猪瘟活疫苗中的猪瘟兔化弱毒病毒，以RT-PCR获得了E2基因的主要编码区的大约250bp大小的节片，在DNAstar上对这些节片的211pb进行了测序，观察到这些节片的编码序列高度同源性，其核苷酸序列和氨基酸序列有98.1%-100%相同，其中9批完全一致，结果表明猪瘟兔毒疫苗株的分子结构极其稳定。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析

利用反转录（RT）及套式PCR（N-PCR）扩增并测定了6株具有不同表症近期甘肃省猪瘟流行野毒及C-株细胞疫苗毒的主要免疫原E2基因的核苷酸序列。序列分析比较结果表明，6株流行野毒与C-株疫苗毒的核苷酸同源性为82%-84%，流行野毒之间的核苷酸同源性在89%-99%之间，并且明显可分为二个组群，病毒株所属组群与其临床症状有一定的相关性。流行野毒与C-株毒在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C-株毒对流行野毒的中和滴度。     

猪瘟病毒辽宁株E2蛋白部分基因片段的序列分析

应用RT-PCR方法对辽宁地区8份猪瘟临床病料进行了E2蛋白部分基因片段扩增，其中有5份病料扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳获得大小约为210bp的目的基因片段。经对目的基因片段回收纯化后进行核苷酸序列测定，并与国内外发表的18株猪瘟病毒株的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较表明，所分离的5株猪瘟病毒株核苷酸序列及氨基酸序列与C1W、C2W等8个毒株的同源性较高，而与国内的疫苗株和强毒株的同源性则较低，基因型差异比较明显，并不归属于同一个基因亚群。本研究通过对E2基因片段扩增以及相应的核苷酸序列的氨基酸序列分析，揭示了本地区猪瘟病毒的分子流行病学背景。     

用金标卡与RT-PCR对猪瘟的快速诊断及其病毒E2基因的序列分析

试验用金标卡对临床检查疑似猪瘟的病猪抗体和抗原分别进行初步检测,同时根据GenBank已发表的猪瘟病毒E2基因的cDNA序列设计并合成1对特异性引物,提取病料总RNA,通过RT-PCR技术扩增长1 137 kb的E2基因片段并进行验证,再将RT-PCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建了重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切和序列测定,说明均已成功获得了猪瘟病毒E2基因和重组体pMD18-T-E2.测序结果与国内外已发表的毒株分别进行序列同源性比较和数据分析及绘制系统进化树,结果表明:该毒株与国内标准毒株Shimen株和C株具有较高的同源性.表明用金标卡结合RT-PCR能对猪瘟进行快速诊断.     

猪瘟病毒石门株不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析

利用RT－PCR及序列测定对猪瘟病毒石门株不同代次毒株E2基因主要抗原编码区及同一代次不同年代主要抗原编码区序列进行了分析，结果所有毒株E2基因主要抗原编码区序列呈现较高的同源性，石门株不同代次毒株E2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为97．7％－100％，97．3％－100％；同一代次不同年代主要抗原编码区序列核苷酸及氨基酸同源性均为98．6％－100％。只有3个代次毒株发生较小的变异，核苷酸及氨基酸呈现1－3个碱基或氨基酸的变异，其他代次的毒株序列完全一致。初步证实了猪瘟病毒分子结构的遗传稳定性，说明猪瘟病毒的变异可能更多的与种群病毒的优势选择有关。     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

咸阳地区猪瘟病毒 E2基因扩增与序列分析

为了解陕西咸阳地区猪瘟流行毒株 E2基因变异情况,采用套式 PCR 方法,扩增了17个流行毒株和2个市售疫苗毒株 E2基因主要抗原区,并进行了序列比对分析。结果表明,17个流行毒株和兔化弱毒株（HCLV）株相比,E2基因主要抗原区核苷酸同源性在79．0％～80．9％,氨基酸同源性在80．0％～84．4％。市售疫苗和 HCLV 株核苷酸同源性为93．4％,氨基酸同源性为90．0％。系统发育树分析发现17个流行毒株同属基因Ⅱ群。流行毒株与 HCLV 相应氨基酸位点相比,总体变异氨基酸位点占26．4％,呈现出典型的变异特征。17个流行毒株在2个氨基酸关键位点出现了705（T→I）、729（L→A）变异现象,可能导致抗原性发生改变。发现 E2蛋白高保守序列 RYLASLH（713～719）变异现象,即 XYSY01株719位发生了 H→R 变异。结果提示,近年陕西咸阳地区猪瘟病毒流行毒株变异较为一致,E2基因核苷酸与编码氨基酸有较明显的变异。     

猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。