鸡plgR多克隆抗体的制备及初步鉴定

根据GenBank中鸡pIgR基因序列和蛋白序列,设计引物,利用PCR技术扩增胞外配体结合区片段,构建原核重组表达质粒pET-32a(+)/pIgR,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG的诱导表达融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡pIgR多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验(ELISA法)和Western Blot法检测抗体的效价和特异性。结果显示,成功制备特异性的鸡pIgR抗体,为研究鸡pIgR的功能提供有力依据。     

人PrP多克隆抗体的制备及鉴定

制备PrP(prion protein)多克隆抗体,验证原核表达的人PrP的抗原性,为PrP空间构象的转变机制等深层次的研究以及人PrP单克隆抗体的制备提供重要的试验材料.以融合的人成熟PrP蛋白(mature prion protein,mPrP)为抗原,以pET30a(+)空载体的E.coli BL21 (DE3)的菌体蛋白作为对照免疫原,免疫小鼠.ELISA和Western blot分别检测多克隆抗体的效价和特异性.结果5只动物中3只均产生了较高效价的抗血清,确定人 PrP多克隆抗体效价为1∶4 096,能与人mPrP特异性结合.证明获得的人mPrP具有良好的免疫原性.     

抗鸡源EphA2蛋白小鼠多克隆抗体的制备及其特性研究

为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原核表达载体转化BL21后经IPTG诱导以及SDS-PAGE分析发现,融合蛋白GST-EphA2-A和GST-EphA2-B均获得有效表达。以纯化的GST-EphA2-A和GST-EphA2-B蛋白免疫小鼠制备了抗鸡EphA2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot试验表明,所制备的抗鸡EphA2多克隆抗体不仅能识别转染pcDNA3.1-EphA2的DF-1及LMH细胞中表达的外源性EphA2,而且还能有效识别内源性鸡源EphA2蛋白。本研究中鸡EphA2的成功表达及其多克隆抗体研制为后续研究鸡EphA2的功能提供了分子生物学工具。     

O型FMDV VP1基因的表达鉴定及其多克隆抗体的制备

为制备O型口蹄疫病毒(FMDV)VPI抗血清,本研究人工合成了FMDV的VPI基因,并克隆构建了采用PCR方法以pUC57-VP1重组质粒,以其作为模板,经PCR将VPI基因亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-VP1.重组质粒鉴定验证后,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示重组蛋白的分子量约为38 ku,以包涵体的形式存在.Western blot与间接ELISA结果显示重组蛋白能够与FMDVFn性血清反应.进一步将纯化的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1:1 600.本研究为FMDV的其他研究工作提供了基础材料.     

猪源T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-1(TIM-1)多克隆抗体制备与鉴定

为了探究猪源T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白-1(sTIM-1)的生物学功能,制备sTIM-1多克隆抗体,通过软件分析sTIM-1蛋白抗原表位及亲水性,并设计引物,以sTIM-1基因为模板扩增sTIM-1黏蛋白功能域编码基因(sTIM-1-M),成功构建了重组表达质粒pET28a-sTIM-1-M,并在大肠杆菌Rosetta 2中诱导表达。以纯化的重组蛋白sTIM-1-M与佐剂混合免疫新西兰大白兔制备多抗血清。SDS-PAGE及Western blot证实了该重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,分子量约为36 kDa。经Western blot与免疫荧光试验(IFA)验证sTIM-1多抗血清可特异性识别293T细胞表达的sTIM-1。免疫沉淀(IP)结果显示制备的多抗血清可与sTIM-1蛋白互作。以上数据表明本研究制备的sTIM-1多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。sTIM-1多克隆抗体的制备为进一步研究sTIM-1参与病毒入侵细胞的机制奠定了基础。     

鸡源抗体制备技术

现在用于研究、诊断以及治疗的抗体主要是来源于哺乳动物的单克隆抗体或多克隆抗体,但多抗和单抗的制备技术技术都有优点及不足。在单抗制备的过程中存在的主要问题是有一些抗原对小鼠是弱免疫原或根本没有免疫原性。在多抗生产和纯化的过程中,多数情况下从哺乳动物血液中制备抗体的产量很低,而且步骤繁琐。     

猪附红细胞体MSG1蛋白的表达和多克隆抗体的制备

本研究将附红细胞体的MSG1蛋白基因按大肠杆菌密码子偏嗜性改造后进行全基因人工合成,合成的基因连接入pBAD/HisB载体后导入大肠杆菌Top10感受态细胞中,进行MSG1诱导表达,确定诱导表达的最佳时间和最佳诱导剂浓度。对表达的蛋白应用His单抗进行了特异性鉴定,对鉴定后的蛋白应用Ni-NTA纯化试剂进行了不同条件下的蛋白纯化。试验结果表明,诱导蛋白的分子量在45 ku左右,加入0.2%的L-阿拉伯糖,诱导2 h后所表达的蛋白量最高。经Western-blot鉴定,该蛋白可以被His单抗特异性识别,经纯化后可以得到较高纯度的MSG1蛋白。表达的MSG1蛋白经纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot证明制备的抗体具有高度的特异性。MSG1蛋白的表达和多抗的制备可以为后续研究附红细胞体的吸附机制、致病机理,以及附红细胞体病的治疗等提供理论基础。     

猪细胞周期蛋白依赖性激酶2多克隆抗体的制备与鉴定

为研究猪细胞周期蛋白依赖性激酶2(pCDK2)的生物学功能,本试验构建重组原核表达载体pET28a-pCdk2,转化大肠杆菌BL21 (DE3)受体菌,用IPTG诱导重组蛋白(rpCDK2)表达并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定,蛋白经纯化及与弗氏佐剂乳化后免疫家兔制备多克隆抗体。分别用Western blotting和免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性。结果显示,成功表达了rpCDK2蛋白,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,可溶性rpCDK2蛋白分子质量约为38 ku,包涵体rpCDK2蛋白在38~43 ku间有3种不同分子质量形式;IPMA检测结果显示,所制备的pCDK2蛋白多克隆抗体与猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)免疫染色呈特异性反应,且Western blotting分析显示,多克隆抗体与这两种细胞的总蛋白反应出现4条特异性条带(分子质量在34~50 ku之间),可能跟pCDK2的多种磷酸化形式有关。本试验利用原核表达系统成功制备了rpCDK2蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的pCDK2蛋白多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。     

SAMHD1蛋白单克隆抗体的制备及SAMHD1不同细胞中的表达鉴定

SAMHD1是最近发现的在人髓系细胞中发挥抗艾滋病毒作用的一种天然蛋白.为制备抗人huSAMHD1蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的人huSAMHD1重组蛋白为免疫原,经腹腔免疫4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA法筛选和4次有限稀释法克隆纯化,获得了1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的MAb与人huSAMHD1的真核表达蛋白呈阳性反应,而与猴、马SAMHD1的真核表达蛋白呈阴性反应,表明其具有很好的特异性,可以用于ELISA、免疫荧光和免疫印迹检测以及对huSAMHD1的进一步研究.     

Intein融合表达鸡IL-2蛋白的多克隆抗体制备

鸡白介素-2(chIL-2)是一种对T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞复制与分化起重要作用的细胞因子,并在机体天然免疫和获得性免疫的发生与维持中发挥重要作用。本研究中,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366bp)克隆连接到pTYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362bp的Intein基因融合在同一开放阅读框内,编码相对分子质量约为71 000的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-intein融合蛋白,应用chitin-sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western blot分析抗体特异性。结果,应用纯化的chIL-2-intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。     

雌二醇多克隆抗体的制备与鉴定

制备雌二醇完全抗原,并通过免疫家兔得到多克隆抗体,为下一步制备雌二醇单克隆抗体和雌二醇检测ELISA试剂盒奠定基础。试验以牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)为载体,采用碳化二亚胺法,合成了雌二醇(E2)的2种免疫偶合物:免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA;通过紫外光谱定性证明偶合物偶联成功与否,并对偶合物的蛋白含量、结合比进行测定并以免疫原E2-BSA免疫家兔,制备多克隆抗体,用包被原E2-OVA进行ELISA,对多克隆抗体特异性及效价进行检测。结果表明成功合成了雌二醇人工抗原即免疫原E2-BSA和包被原E2-OVA,二者的蛋白浓度分别为5.455和7.533mg/mL,结合比分别为7:1和8:1;制备的多克隆抗体特异性好,血清效价为1:106。     

盖塔病毒非结构蛋白NSP1多克隆抗体的制备及鉴定

试验旨在获得能够特异性识别盖塔病毒(Getah virus, GETV)非结构蛋白NSP1的抗体,用于鉴定NSP1蛋白及其分布。采用RT-PCR技术扩增GETV的非结构蛋白NSP1基因,构建了NSP1蛋白的原核表达质粒pET-NSP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导大量表达。纯化原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了NSP1蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10⁵以上。Western blot和免疫荧光试验(IFA)结果显示,NSP1蛋白多克隆抗体与GETV有良好的反应性。NSP1蛋白多克隆抗体的制备,为进一步研究该蛋白在盖塔病毒复制周期中的功能奠定了基础。     

鸭抗菌肽Dcath多克隆抗体的制备及鉴定

为制备效价高、特异性强的鸭抗菌肽Dcath多克隆抗体,并对制备的多克隆抗体进行鉴定和初步应用,采用Fmoc固相化学合成法合成鸭抗菌肽Dcath的成熟肽段,与血蓝蛋白偶联后,与弗氏完全佐剂乳化,按照免疫程序免疫接种大白兔,采集免疫兔血清,亲和层析纯化多抗,ELISA检测多抗效价,以制备的多抗为一抗,用Western blot检测鸭血外周异嗜性粒细胞中Dcath的表达,用免疫组化(IHC)检测鸭回肠、肾脏组织中Dcath的表达。结果显示,合成的鸭抗菌肽Dcath纯度达98.28%,经ELISA检测,纯化的兔多抗效价达到1∶128000,经Western blot检测,鸭血外周异嗜性粒细胞大量表达Dcath,经免疫组化检测,鸭Dcath在肾脏及回肠组织细胞中广泛表达。结果表明,成功制备了鸭抗菌肽Dcath多克隆抗体,效价高、特异性强,为深入研究鸭抗菌肽Dcath的生物学特性提供了技术支持。     

苯巴比妥多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

苯巴比妥（Phenobarbital, PB）具有神经、骨髓、致畸、致癌等毒性作用,其在动物性食品中的残留严重危害着人们的健康,我国和世界上多数国家禁止PB用于食品动物.免疫学分析方法用于PB残留检测以其灵敏、快速、特异、简便等优点替代了传统的理化检验方法,美国雅培公司和德国Dade Behring公司已开发出相关产品.合格的抗体是建立免疫学分析方法的基础,关于PB多克隆抗体（pAb）的制备国内尚未见报道.本研究旨在制备出高价、敏感、特异的PB pAb,为免疫学检测方法的建立奠定基础。     

犬红细胞抗原1.1血型多克隆抗体的制备与鉴定

为了制备犬红细胞抗原1.1(DEA1.1)血型多克隆抗血清,用犬血型快速检测卡分别鉴定DEA1.1阳性犬和DEA1.1阴性犬,用DEA1.1阳性犬完整红细胞免疫DEA1.1阴性犬。多次免疫后采集阴性犬血清,用抗球蛋白血凝试验验证多抗血清的符合率。结果显示,制备的多抗血清与商品化的多抗血清符合率为98%。抗球蛋白试验检测抗体血凝效价为211。试验表明,制备的犬血型DEA1.1多克隆抗体能达到血型鉴定的要求,能满足国内犬临床输血中DEA1.1血型检测的要求。     

熊蜂SMRTER蛋白多克隆抗体的制备

熊蜂是重要的传粉昆虫,在促进农业生产及维护生态系统平衡等发面发挥着重要作用。Smr基因编码的蛋白为SMRTER(SMRT-related and ecdysone receptor interacting factor),是一个转录因子。在模式生物中发现,Smr基因参与调控包括器官发育、代谢及其他多个重要的生物学过程。本研究利用基因合成技术获得熊蜂Smr基因的编码序列,并把它克隆进原核表达载体进行诱导表达,产生SMRTER重组蛋白。然后,利用纯化的SMRTER蛋白制备兔抗SMRTER多克隆抗体。进一步的检测发现,此多克隆抗体对SMRTER蛋白具有良好的特异性。该研究对于更好理解Smr基因在熊蜂中所发挥的生物学功能具有重要的意义。     

鸡toll样受体7的克隆表达及多克隆抗体的制备

本试验旨在制备兔抗鸡toll样受体7(chicken toll-like receptor 7, chTLR7)多克隆抗体,根据GenBank已发表的chTLR7序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增chTLR7胞外区基因片段,并构建原核表达重组质粒,通过优化蛋白表达条件,用获得的融合蛋白免疫兔制备多克隆抗体,通过免疫印迹及间接免疫荧光试验鉴定制备的兔抗chTLR7多克隆抗体的特异性。结果显示,该片段长度为1 122 bp,与预测的片段大小、碱基序列一致。构建的原核表达重组质粒pGEX-6P-1-chTLR7经IPTG诱导后,表达出预期63 kDa的重组蛋白,免疫兔可产生特异性抗体。制备的兔抗chTLR7多克隆抗体具有良好的特异性,为后续实验研究chTLR7传导通路、免疫机制等相关研究提供有利工具。     

己烯雌酚多克隆抗体的制备和鉴定

用混合酸酐法合成的BSA-DES免疫兔子,制备抗DES的特异性抗体,分别用混合酸酐法和碳二亚胺法合成的OVA-DES作为包被原检测抗体;用混合酸酐法合成的OVA-DES和碳二亚胺法合成的OVA-DES免疫小白鼠,制备抗DES的特异性抗体,分别用混合酸酐法合成的BSA-DES和碳二亚胺法合成的BSA-DES作为包被原检测抗体。检测结果表明:三种免疫原免疫动物,都产生了DES的特异性抗体,并建立了间接阻断ELISA法。这为残留DES酶免疫检测试剂盒的制备奠定了基础。     

猪博卡病毒VP1蛋白的多克隆抗体制备及初步应用

旨在制备猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV) VP1蛋白的多克隆抗体.利用PCR技术对PBoV VP1蛋白的基因进行扩增,将所获基因克隆入原核表达载体,将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达.纯化后的目的 蛋白与ISA206佐剂混合后通过背部皮下免疫日本大耳白兔,3次加强免疫后,收集兔血清,利...     

鸡干扰素调节因子7的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达鸡干扰素调节因子7蛋白并制备其多克隆抗体,通过RT-PCR技术扩增chIRF7基因的编码序列,构建重组质粒PET30a-chIRF7。将重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示,重组蛋白rchIRF7分子量约为60ku。将纯化的重组蛋白免疫接种小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA测定血清抗体滴度在1∶51 200以上,IFA检测结果显示制备的鼠抗chIRF7蛋白多抗能够与AIV刺激的CEF细胞内的chIRF7蛋白发生特异性反应,表明通过原核表达系统表达的重组蛋白rchIRF7具有很好的免疫原性,以其制备的鼠抗chIRF7蛋白多克隆抗体滴度高、特异性好。