蒙古冰草ERF转录因子生物信息学及其表达分析

ERF(Ethylene responsive factor)家族是植物中一种重要的转录因子,参与植物生长发育和逆境胁迫响应。为筛选蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)抗旱相关的ERF转录因子,本研究利用生物信息学方法对其理化性质、亚细胞定位、保守基序、进化关系及其二、三级结构进行分析,同时对不同干旱处理下的ERF基因进行表达分析。结果显示：筛选得到18个具有ERF结构特征的蒙古冰草ERF转录因子,蛋白大小在70～404aa之间,分子质量在7447.54～43654.9之间,理论等电点(PI)在4.53～11.10之间,其中有2个疏水性蛋白,其余均为亲水性蛋白,大部分定位于细胞核。ERF转录因子的二、三级结构以无规则卷曲为主,推测motif1,motif2,motif3为保守基序。进化关系比对发现AmERF053,AmERF1B,AmERF4-1,AmERF4-2与已知具有抗旱功能的蛋白具有较高同源性,且在干旱处理的蒙古冰草中显著差异表达。     

蒙古冰草肌动蛋白基因片段的克隆与组织表达分析

本研究利用同源序列法分离蒙古冰草Actin基因同源片段,并分析蒙古冰草Actin基因在根、茎、叶中的表达特征。根据禾本科植物小麦Actin基因的保守序列设计1对引物A1,经RT-PCR扩增,从蒙古冰草cDNA中克隆到1个长度为541 bp的Actin基因片段,使用DNAman和DNAUSER等分子生物学软件进行序列分析,结果表明,该序列编码179个氨基酸,并推测该片段具有Actin超基因家族的保守结构域,含有1个ATP结合位点,抑制蛋白结合位点和胶溶蛋白结合位点;该基因片段的氨基酸序列与小麦Actin基因的同源性为99%,与玉米同源性为96%,与水稻同源性为93%。组织器官特异性表达分析结果表明,该基因在根、茎、叶中的表达量恒定。将该基因片段命名为MwACT1,并在GengBank中登记注册,登录号为FJ490410。     

蒙古冰草肌动蛋白基因(MwACT2)克隆与表达分析

本研究应用RT-PCR和RACE技术,从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)中分离到1个肌动蛋白基因,命名为MwACT2。序列分析表明:MwACT2基因全长1506bp,含有1个1131bp的开放型阅读框,MwACT2蛋白长度为376个氨基酸残基,分子量为41.606KDa,理论等电点为5.29,含有actin保守位点,属于actin家族成员。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中乌拉尔图(Triticum_urartu)肌动蛋白(登录号:EMS62134.1)氨基酸具有99%的一致性,属于非跨膜蛋白。利用半定量RT-PCR技术分析MwACT2基因的表达,结果表明该基因表达稳定,经高盐、干旱、低温处理后的表达强度无显著差异。     

蒙古冰草MwDREB3基因的克隆及表达分析

以蒙古冰草(Agropyron mongolicum)为研究材料,利用同源序列法克隆得到1个DREB3类转录因子基因,命名为MwDREB3,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析MwDREB3 基因的表达特征,为蒙古冰草优异抗性基因的挖掘和利用提供理论依据.结果表明:该基因全长1056bp,包含1个完整的开放阅读框,长度为774bp,编码257个氨基酸,该蛋白近5'端含有1个保守的AP2结构域.系统进化树分析表明MwDREB3 编码的蛋白与小麦(Triticum aestivum)的DREB、山羊草(Aegilops columnaris)DRF1的进化关系较近.该基因在干旱、高盐、ABA诱导条件下,表达量上调;在低温条件下,表达量下调.     

蒙古冰草全长转录组分析及参与木质素合成和干旱响应的羟化酶基因鉴定

蒙古冰草(Agropyron mongolicum)是广泛分布于我国北方荒漠草原地区的优质牧草,对寒冷、干旱、盐碱等环境胁迫具有很强的耐受性,具有很高的生态、经济和育种价值。然而,蒙古冰草基因组和转录组数据信息的缺乏严重限制了蒙古冰草的分子育种和开发利用等工作。本研究利用PacBio三代测序平台对蒙古冰草进行测序研究,获得了高质量全长转录组信息。对测序结果的组装获得了267 560个全长转录本,从中筛选出91 855条Unigene并注释了其中的83 125个。更进一步地从蒙古冰草全长转录组中挖掘了可能参与木质素合成的羟基转移酶基因。对这些基因在不同组织中以及干旱胁迫下的表达模式的研究表明,这些基因可能在木质素合成和干旱胁迫响应中发挥重要功能。本研究提供了蒙古冰草的高质量全长转录组资源,为挖掘蒙古冰草的优异基因资源提供了便利条件。     

与蒙古冰草抗旱相关的NAC转录因子生物信息学及其表达分析

NAC转录因子具有调控植物生长发育及应对非生物逆境胁迫等多种功能。为筛选蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）抗旱相关的NAC转录因子,本研究基于转录组测序数据,利用生物信息学方法对蒙古冰草NAC转录因子的结构、理化性质、进化关系和保守性等进行分析,同时运用实时荧光定量技术对抗旱相关的2个NAC基因进行差异表达分析。结果表明：筛选出26个蒙古冰草NAC家族成员,其中15个具有完整NAC转录因子结构域,其均属于亲水性蛋白,大部分定位于细胞核;15个蒙古冰草NAC转录因子的蛋白磷酸化位点均含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。进化关系比对显示AmNAC100和AmNAC102-2转录因子与已知有抗旱功能的NAC蛋白同源性极高,其二、三级结构主要以无规则卷曲为主,motif1,2,3,8为其共有的保守基序,多序列比对将保守结构域划分为子域A—E。差异表达分析发现AmNAC100和AmNAC102-2基因相对表达量均高于对照（CK）,在蒙古冰草干旱胁迫中起正调控作用。     

扁穗冰草脱水素基因的克隆和表达特性分析

扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn)生长于干旱、半干旱地区,具有耐旱、耐寒、抗病等特性。采用RT-PCR技术从扁穗冰草叶片中克隆3个脱水素基因Acwcor410,Acwzy2和Acwcs120)和1个肌动蛋白β-actin基因(Acβ-actin)。半定量RT-PCR分析表明,Acwcor410基因对温度敏感,对干旱胁迫不敏感;Acwzy2基因对温度不敏感,而对干旱胁迫敏感;Acwcs120基因则对冷胁迫及干旱胁迫均有响应。Western blot表明,扁穗冰草含有40kD脱水素,该蛋白的表达随冷胁迫和干旱胁迫程度的变化而变化,对干旱胁迫的响应比冷胁迫更为明显,推测该脱水素属于干旱敏感型。     

蒙古冰草分子核型分析

利用荧光原位杂交技术,在蒙古冰草染色体组上进行5S rDNA、45S rDNA以及重复序列pAs1 DNA序列的定位,通过荧光原位杂交信号的强弱、数量、位置进行蒙古冰草染色体的配对及核型分析.结果 表明:蒙古冰草染色体组总长度为91.788μm,平均绝对长度为13.113μm,最长染色体与最短染色体的长度比值为1.44...     

蒙古冰草遗传多样性的等位酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测了内蒙古中东部地区蒙古冰草6个天然居群和2个栽培品种的遗传多样性和居群结构，12个酶位点的多态位点百分率为67.71%，基因多样性指数（He)为0.285，显示出了较高的遗传多样性，从遗传多样性的分布格局来看，8个居群的遗传分化系数Gsr=0.129，表明在总的遗传变异中，只有12.9%的变异存在于居群间，而87.1%的变异存在于居群内，同时，6个天然居群的总基因多样度（HT=0.439)和基因分化系数（GST=0.032)也大于2个栽培品种的相应值（HT=0.423,GST=0.010)。UPGMA聚类分析的结果表明，蒙古冰草居群间的遗传分化与生态环境因子间有着密切的相关性。     

日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子,参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因,并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽,具有疏水性,系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示,该基因在幼嫩叶片中大量表达,随植物发育表达量逐渐减少,但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

脱水素基因转化紫花苜蓿及其初步抗旱性分析

为了获得抗旱性较强的转基因苜蓿,试验以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌介导,转化到中苜2号中。试验结果表明,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,外植体与农杆菌的共培养时间以5d为最佳,试验共获得126株抗性再生植株;PCR和RT-PCR鉴定后,得到了11株阳性转基因苜蓿;通过干旱处理后,经初步的表型和脯氨酸分析显示,转基因苜蓿具有较强的抗旱能力。     

维氏气单胞菌TH0426株主要黏附素基因的克隆、生物信息学分析及原核表达

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)主要黏附素Aha1基因的生物信息学特性,本试验克隆了A.veronii TH0426主要黏附素Aha1基因片段,构建了Aha1基因序列进化树,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构,并进行了Aha1蛋白的原核表达及免疫原性的检测。结果显示:Aha1基因全长1 038bp,编码345个氨基酸。TH0426株Aha1与A.veronii属同一分支,具有信号肽,跨膜区,二级结构以β折叠、无规则卷曲为主。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,Aha1蛋白在大肠杆菌中成功表达且其能被鼠抗黏附素阳性血清识别,表明Aha1蛋白具有一定的反应原性。以上结果为进一步研究Aha1蛋白的结构功能Aha1基因工程亚单位疫苗的制备奠定了基础。     

结缕草ZjCSD基因的克隆及表达分析

铜锌超氧化物歧化酶是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶,其含量和活性与植物抗逆性密切相关。本研究以结缕草cDNA为模板,利用同源克隆法,从结缕草转录组数据库中克隆获得了结缕草ZjCSD基因,该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析结果显示:ZjCSD基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,定位于细胞质中,含有CSD蛋白家族特有的保守结构域,具有典型的Cu²⁺和Zn²⁺结合位点;与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性,进化关系较近。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式,结果表明,ZjCSD基因在根、茎、叶中都有表达,叶中表达量最高;干旱胁迫(30% PEG)、盐胁迫(150 mmol/L NaCl)和Cd²⁺胁迫(200 mg/L Cd²⁺)均能诱导ZjCSD基因表达量上调,Pb²⁺胁迫(1 g/L Pb²⁺)诱导ZjCSD基因表达量下调。故推测结缕草ZjCSD基因在结缕草应对干旱、盐和重金属胁迫的过程中发挥作用。     

洋草麦HdCAD基因的克隆与生物信息学分析

[目的]克隆洋草麦肉桂醇脱氢酶基因（HdCAD）,揭示HdCAD基因的序列特性,对HdCAD蛋白进行生物信息学分析。[方法]以洋草麦转录组数据中的HdCAD为参考序列,设计1对特异引物,利用RT-PCR技术克隆HdCAD基因;利用生物信息学软件对HdCAD基因序列进行分析,对HdCAD蛋白的理化性质、蛋白结构、亚细胞定位等进行预测和系统进化树分析。[结果]HdCAD基因编码区全长1 071 bp,共编码356个氨基酸。HdCAD蛋白含有17个磷酸化位点,不含有跨膜结构域和信号肽位点,预测定位在细胞质中;二级结构中,以无规卷曲元件占比最高;含有1个典型的CAD1结构域,属于MDR超家族。系统进化树分析结果显示,HdCAD蛋白与二粒小麦、节节麦、西藏裸大麦亲缘关系最近。[结论]该试验成功克隆HdCAD基因、预测了该基因编码蛋白的序列特征和功能,可以为今后研究洋草麦抗非生物胁迫功能提供参考。     

绵羊NYD-SP27基因的原核表达及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊NYD-SP27基因进行克隆和原核表达,并对其表达的蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中绵羊NYD-SP27基因序列（登录号：KX905090）设计1对特异性引物,通过PCR方法扩增目的基因片段,构建pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒并转化E.coli DH5α感受态细胞,提质粒进行双酶切鉴定,将鉴定正确的pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,对融合蛋白进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并利用生物信息学方法对NYD-SP27基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,试验成功扩增出大小为1 617 bp的NYD-SP27基因片段,并经NdeⅠ和Xho Ⅰ双酶切获得大小为5 400和1 617 bp的两条片段,表明成功构建了pET-22b（+）-NYDSP27重组质粒,诱导表达重组蛋白大小约60 ku,主要以包涵体的形式存在。NYD-SP27蛋白分子式为C₂₇₉₈H₄₃₁₉N₇₃₇O₈₁₉S₁₉,原子总数为6 892,理论等电点（pI）为6.16,为酸性蛋白,不稳定系数为46.96,属于不稳定蛋白,总平均亲水性为-0.403。该蛋白无跨膜结构,无信号肽,含有45个潜在的磷酸化位点和24个抗原表位;NYD-SP27蛋白二级结构中的α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲分别占26.21%、3.90%、18.03%和51.86%。本试验结果可为深入研究绵羊NYD-SP27蛋白的作用机理提供理论依据。     

蒙古冰草与航道冰草正反交杂种染色体加倍植株F_2的ISSR分析

利用ISSR分子标记技术对蒙古冰草与航道冰草正反交杂种染色体加倍植株F2代间及其与亲本和杂种F1代间在DNA分子水平上的遗传差异性进行分析,结果表明:12个ISSR适宜引物共扩增出515个条带,多态性条带492个,多态性条带百分率为95.3%。6个供试材料间的遗传距离(GD)变幅为0.4094~0.6721,平均为0.5391,亲本航道冰草与蒙古冰草间、航道冰草与正反交杂种染色体加倍植株F2间的遗传距离较大,正反交F1间的遗传距离次之,正反交杂种染色体加倍植株F2间的遗传距离相对较小。以GD值0.51为基准,6个材料聚为3类:第一类为蒙古冰草、反交杂种F1,第二类为正交杂种F1、正反交杂种加倍植株F2,第三类为航道冰草。     

扁蓿豆SK2型脱水素基因MrDHN3的异源表达提高大肠杆菌对盐和高温胁迫的抗性

扁蓿豆为高原高寒地区优质豆科牧草,具有极强的抗旱、耐寒、抗盐碱的能力。脱水素(DHNs)是参与植物逆境应答的一类蛋白。根据前期RNA-seq的结果,从扁蓿豆幼苗中克隆到一个编码脱水素的基因MrDHN3。序列分析显示该基因含666 bp的开放阅读框,编码221个氨基酸,为一个SK2型酸性脱水蛋白。氨基酸序列比对结果表明,MrDHN3与豆科植物白三叶和蒺藜苜蓿相似性最高,达83%。实时荧光定量PCR结果显示,MrDHN3基因受脱水、低温、高盐和脱落酸处理诱导表达,表明MrDHN3参与了扁蓿豆的非生物胁迫响应。通过构建原核表达载体,在大肠杆菌中过表达MrDHN3蛋白,检测重组菌在盐和高温胁迫处理下的生长存活情况。结果发现,在0.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L KCl高盐胁迫条件下,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株;在55 ℃高温胁迫条件下, 转化大肠杆菌的生长状态明显优于对照。表明MrDHN3对盐和高温引起的细胞损伤具有保护作用。为今后作物抗逆性遗传改良的研究提供了有用信息。     

冰草的远缘杂交及杂种分析

蒙古冰草隶属于冰草属的二倍体种，原产于内蒙古。航道冰草是从北美引进的栽培品种隶属于扁穗冰草种，亦为二倍体种，为了将蒙古冰草的优良抗性基因和航道冰草的优良品质基因相结合，进行二倍体种间的远缘杂交。杂种Ｆ１全部为二倍体，其形态学特征介于双亲之间。杂种Ｆ１ ＰＭＣ ＭⅠ的染色体平均配对构型为：２．０９Ⅰ，４．８６Ⅱ，０．４８Ⅲ，０．２４Ⅳ及０．２９Ⅴ。     

三穗鸭肌肉生长抑制素基因的生物信息学分析

采用PCR产物直接测序的方法获得肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因的编码区序列,并运用生物信息学方法对该基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、二级结构、三级结构和功能结构域进行分析。结果表明,三穗鸭MSTN蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,作为信号肽的可能性很大;含有22个α螺旋、26个β折叠、26个T转角、20个无规则卷曲,有1个跨膜结构,具有TGF-β的主要结构。研究结果为MSTN基因的进一步研究提供参考。     

牦牛附睾组织不同区段防御素家族基因的表达谱和生物信息学分析

牦牛是高原地区牧民收入的主要经济来源之一,如何提高牦牛的繁殖力一直备受关注。β-防御素是一类具有广谱抗菌活性的肽,研究牦牛β-防御素（Bos mutus β-defensins,bBD）家族在附睾的表达具有重要意义。本实验使用实时荧光定量PCR技术分析牦牛附睾不同区段β-防御素基因的表达情况。结果显示,共有9个β-防御素基因在附睾头、体和尾的表达存在极显著差异。bBD109、bBD119、bBD121、bBD123、bBD128、SPAG11基因集中于附睾头部表达;bBD125与bBD136集中于附睾体部表达;bBD15同时在附睾头部和体部高表达。结合生物信息学分析发现,这9种β-防御素均存在保守的氨基酸序列、反向折叠的β-转角;bBD136脂溶性最高、疏水性强,bBD125和SPAG11相反;β-防御素基因编码蛋白均为不稳定蛋白（bBD123除外）,并且预测分析都存在SP型信号肽（除bBD125外）;β-防御素家族基因在附睾不同区段的差异性表达情况以及编码蛋白质的各种理化性质与结构组成等特征都表明其可能在精子成熟过程中发挥着重要作用。