“光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

采用磁珠富集法(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)构建"光合1号"新品种中华绒螯蟹Eriocheir sinensis基因组微卫星文库。用PCR法对225个单菌落进行鉴定,共获得168个阳性克隆,测序发现有94个含有微卫星座位,其准确率为55.95%,其中单元重复次数为5～10的序列占34.04%,重复次数为10～20的序列占20.21%,重复次数大于20的序列占45.75%,重复次数最高达到92次;完美型微卫星座位69个(占73.40%),非完美型微卫星座位17个(占18.09%),混合型微卫星座位8个(占8.51%);根据微卫星侧翼序列设计并合成53对引物,检测结果显示,有31对(占58.50%)引物能够扩增出特异性条带;选择其中14对多态性良好的引物用于中华绒螯蟹辽河野生群体的遗传多样性分析,共检测到148个等位基因,单个位点等位基因数为7～13个,平均为10.6个,观测杂合度为0.214 3～0.666 7,期望杂合度为0.825 4～0.910 1,多态性信息含量为0.766 3～0.865 4。     

刺参微卫星DNA分子标记的分离及筛选

采用磁珠富集法分离刺参Apostichopus japonicus的微卫星分子标记,共获得阳性克隆123个,其中106个含微卫星DNA序列。分析结果表明:完美型有48个,占45.28%,非完美型有39个,占36.79%,复合型有19个,占17.92%;重复碱基数以双核苷酸重复最常见,占84.91%,双核苷酸中又以CA/GT重复所占比例最大;在重复次数方面,以重复数为3~10次、11~18次和≥35次最为常见,各占39.62%、26.42%和16.98%,重复数达100次以上的有5个,最多的达到148次,有28个微卫星序列微卫星含量丰富。筛选的22对引物中,可产生出扩增产物的有17对,其中16对引物的产物带在预测区域内出现;有7对引物在中国、俄罗斯刺参模板中表现出多态性。文中还对刺参微卫星的特点进行分析,对刺参微卫星引物的PCR筛选结果进行了探讨。     

杨树锈菌表达序列微卫星分析及EST-SSR标记开发

通过对64 498条杨树锈菌EST进行拼接,得到1 998个拼接片段(contigs),发现了604个SSR位点。在拼接片段中SSR平均密度为每736.6 bp含有1个SSR。在SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占总数的44.70%。在二碱基重复中,最主要的优势重复单元是AC和AT,三碱基中AGT和AAG为优势重复单元,四碱基、五碱基重复类型中,(AAAN)n和(AAAAN)n为对应的优势重复单元,这些优势重复单元中富含碱基A和T,研究还发现杨树锈菌表达序列中微卫星丰度很高。杨树锈菌突变频率很高,由试验结果推测杨树锈菌基因中含有的微卫星序列是杨树锈菌基因变异的一个重要驱动力。杨树锈菌EST序列中高度变异的微卫星(长度大于20 bp)约占15.07%。针对检测到的微卫星位点,共设计了455对引物,并选取了30个SSR引物对对杨树锈菌基因组DNA进行PCR扩增,其中有27个引物对扩增成功,占90.0%。扩增产物电泳结果显示,有21个引物对扩增出的谱带在预期片段大小范围之内,有8个引物对在杨树锈菌DNA中检测到了多态性,多态性引物对占26.7%。     

草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组中存在的微卫星资源.结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列.其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%.另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等.在68个微卫星标记中,有15个依据引物设计原理设计了引物.     

用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

草鱼基因组中微卫星分子标记的制备及筛选

采用新型的生物素-磁珠吸附微卫星富集法与传统的放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组中存在的微卫星资源.结果,从1 000个细菌中,挑出90个阳性克隆,把其中45个进行测序分析,在这些序列中共含有68个微卫星核心序列,有55个含有重复次数大于5次的微卫星核心序列.其中,单一型标记49个,占72%,包括CA重复单元共22个,GT重复单元共18个,其他重复单元为9个;在72%的单一型标记中,完美单一型微卫星标记为44个,占65%.另外,混合型标记共19个,13为完美混合型;在所有微卫星标记中,CA重复类型最普遍,依次为GT、GA等.在68个微卫星标记中,有15个依据引物设计原理设计了引物.     

三疣梭子蟹微卫星文库的构建及序列分析

采用磁珠富集法筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星序列。经Sau3AI酶切后的200~1000bp DNA纯化片段,与两端已知序列的人工接头连接,用含有生物素标记的(CA)₁₂和(GA)₁₂探针杂交,根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性,捕获含微卫星序列的单链DNA,以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,随后将获得的片段连接到PMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,成功构建了微卫星富集文库。测序其中的60个阳性克隆,得到42条微卫星序列(基因登录号为:HQ283153-HQ283194),除探针使用的CA/GT、GA/CT重复外,还得到GAGT重复序列。42条微卫星序列中,完美型31个(占73.8%),非完美型9个(占21.4%),混合型2个(占4.8%)。完美型的比例显著高于非完美型,这与其他真核生物微卫星序列的特征相一致。39条微卫星序列的重复次数大于10(占92.9%),其中,重复次数在10~19次之间的有27个,20次以上的有12个。筛选出的微卫星位点可为今后三疣梭子蟹遗传多样性评价、种群遗传结构鉴定及资源保护研究提供一套有用的分子标记。     

云南松基因组微卫星序列特征分析

为了更好地了解云南松基因组特征,分析了云南松基因组中微卫星序列的分布特征,采用FLAF-seq测序技术,共获得1 970条微卫星重复序列,利用MISA通过对Unigene序列的分析,鉴定出7种类型的SSR。7种微卫星序列中主要以单碱基重复类型为主,共1 104个,约占重复序列总数的56.04%,其次是双碱基和三碱基重复类型,分别占总数的27.66%和11.68%,四碱基重复类型数量30个,占重复序列总数的1.52%,五碱基、六碱基重复类型在总重复序列中占比最少,均为0.2%,混合微卫星占2.7%。在单碱基重复类型中占优势的重复单元是A/T碱基,双碱基重复类型中占优势的重复单元是(AT)_n/(TA)_n碱基,三、四、五碱基重复类型中,占优势的重复单元不明显,但几种碱基重复类型中,都包含着丰富的A和T。所得到的微卫星重复序列中以长度20bp序列的微卫星数量最多,微卫星长度≥20bp的只占总数的10.81%。可为后续云南松遗传多样性的研究及SSR引物筛选等提供一定的理论依据。     

鲢三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选及其特征分析

通过磁珠富集法筛选鲢(Hypophthalmichtys molitrix)的三、四核苷酸重复微卫星分子标记。提取鲢血液大片段基因组DNA,用限制性内切酶Sau3AI进行酶切,蔗糖密度梯度离心收集400~900 bp长度的片段,构建鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针(TGA)8、(CAG)8以及(AGAT)6进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pMD 18-T载体,转入感受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得微卫星文库;再用γ-32P标记的放射性同位素探针进行二次杂交筛选,获得1 758个阳性克隆,选择测序348个克隆序列中,共含有280个微卫星座位,其中完美型167个(59.64%),非完美型28个(10%),混合型85个(30.36%)。Primer 3.0软件设计60对引物,并用珠江水系的野生鲢群体对引物进行多态性位点检测。统计软件分析显示其中22对具有较高的筛选效率和多态性,可作为鲢种质评价等遗传分析的工具。研究亮点:首次利用多碱基(三、四核苷酸重复)探针筛选出微卫星分子标记结合同位素探针进行两次筛选...     

中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选

利用磁珠富集和放射性杂交相结合构建了中华绒螯蟹基因组微卫星文库.并利用生物素标记的(GA)12探针进行微卫星片段的富集.将得到的片段与pGEM-T载体连接后转入DHSα大肠杆菌中,然后利用γ-32P同位素标记的(GA)12:探针进行第二次筛选.结果共获得微卫星基因组文库1 500个菌,杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为62.5%;杂交后得到的阳性克隆为447个,占29.8%.经测序,有248个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列.在得到的微卫星序列中,重复单元除GA/CT外,还观察到三碱基、四碱基重复单元.根据侧翼序列没计引物164对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有21对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,15对具有多态性.本研究对中华绒螯蟹基因组资源的开发利用提供了相关资料.     

大菱鲆微卫星标记的分离及其多态性位点检测

以生物素标记的（CA）12为探针进行杂交,借助磁珠筛选出含微卫星的Mbo I酶切片段,构建了大菱鲆Scophthalmus maximus微卫星富集文库,用同位素γ-^23P标记的探针（CA）12进行二次筛选,获得1600个阳性克隆,占59．3％。测序347个序列,得到335个（96．54％）含有微卫星序列的克隆,其中含有微卫星座位378个。完美型的微卫星序列有236个（62．4％）,非完美型的有121个（32．0％）,复合型的有21个（5．6％）,从所得序列中分离和鉴定了32对微卫星标记。利用31尾大菱鲆养殖个体评价微卫星位点,分析表明,10个位点具有多态性。不同位点等位基因数目为3～11不等,期望杂合度（He）和多态信息含量（PIC）变动范围分别为0．5061—0．8995和0．4133～0．8742。本研究中开发的微卫星多态性较高,将为大菱鲆养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等打下基础。     

芙蓉鲫（芙蓉鲤♀×红鲫♂）及其原始亲本间的遗传关系

利用RAPD和微卫星标记技术,对芙蓉鲫及其原始亲本（红鲫、芙蓉鲤、散鳞镜鲤、兴国红鲤）5个群体的遗传关系进行研究。利用20条随机引物进行RAPD分析,其中12条在5个群体中均能扩增出特异条带。统计分析显示：芙蓉鲫与红鲫、芙蓉鲤、散鳞镜鲤、兴国红鲤的遗传相似性分别为0.8757、0.7478、0.7419、0.7449,遗传距离分别为0.1327、0.2906、0.2985、0.2944。在进行微卫星标记分析时,所扩增的29对微卫星引物中共有13对在5个群体中均能扩增出特异条带。统计分析显示,芙蓉鲫与红鲫、芙蓉鲤、散鳞镜鲤、兴国红鲤的遗传相似性分别为0.8717、0.7434、0.6680、0.7552,遗传距离分别为0.1374、0.2965、0.4034、0.2808。两种分析结果均表明,芙蓉鲫的遗传结构更接近于父本红鲫,与外祖父兴国红鲤的遗传相似性比与外祖母散鳞镜鲤的遗传相似性要大,其遗传结构更偏向于具红色体征的原始亲本。     

鳢性别控制育种及应用研究进展

鳢(Channa)是我国重要的淡水鱼类,具有较高的经济价值.鳢普遍存在显著的性别二态性,雄性个体生长速度快、个体大、饲料系数低,因此,全雄单性养殖具有重大的经济意义.阐述了全雄乌斑杂交鳢性别控制育种过程:利用性别分子标记辅助育种技术和生殖内分泌调控技术创制超雄斑鳢新种质,开展母本乌鳢2代群体选育,然后超雄斑鳢与选育的母...     

曼氏无针乌贼微卫星DNA富集文库构建与鉴定

曼氏无针乌贼是我国四大海产之一,开发其微卫星标记具有重要的科研与应用价值。本研究采用FIASCO法（Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats）构建了曼氏无针乌贼的（CA）n微卫星富集文库,通过PCR检测出640个阳性克隆,占所有克隆的87%,从阳性克隆中随机选取118个进行测序,序列分析发现,103个克隆含有7次以上的重复序列,其中完全的为67（65%）个,不完全的23个（22.3%）,复合的为13（12.7%）个,重复次数范围为7~59次,平均为38次。在103个序列中共42条可以设计引物,所筛选出的引物可以用于评估曼氏无针乌贼种质资源遗传多样性、遗传结构、亲子鉴定以及放流效果评估等。     

山核桃SSR标记的初步开发

基于山核桃Carya cathayensis脂肪代谢相关cDNA文库的部分测序结果,发现43条cDNA序列具有简单重复序列(SSR)碱基重复特点,用Primer Premier 5设计了34对表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)引物;建立了适用于山核桃的SSR分析体系,并用设计的SSR引物对对天然群体山核桃40个样品进行了初步的应用性试验.结果表明:34对引物中有4对无扩增产物,3对引物的扩增产物超过了设计范围,27对引物在供试的40个山核桃材料中有较清晰且稳定的目标扩增产物,其中有18对引物的扩增产生了22个多态性位点,占总扩增位点数的47.8％.将SSR标记分析结果与山核桃已有的显性标记分析结果进行比较,发现SSR标记多态性位点的比例较高,且能够区分显性纯合位点及显性杂合位点.结论:设计开发山核桃的EST-SSR标记是可行有效的.     

黄鳝微卫星标记筛选及其在不同性别表型群体中的遗传多态性

采用FIASCO(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats)法进行黄鳝微卫星标记筛选并将其应用于黄鳝性别差异群体的遗传变异分析.黄鳝基因组DNA经酶切、微卫星核心序列探针杂交、T载体连接并转化至DH5a中,构建黄鳝基因组微卫星富集文库.随机挑选75个阳性克隆测序,结果发现其中20个含有微卫星序列,利用软件成功设计了15对微卫星引物,经过黄鳝基因组DNA的PCR扩增及电泳检测,筛选8对多态性微卫星引物并对黄鳝3种不同性别表型群体的基因组DNA进行PCR扫描,结果显示:在8个微卫星座位中,共检测到51个等位基因,平均每个座位的等位基因数为6.375个,等位基因频率分布为0.001 2～0.603 3;黄鳝雌性表型群体、间性表型群体、雄性表型群体的平均遗传杂合度分别为0.637 1、0.696 9、0.734 5;平均多态信息含量分别为0.565 6、0.641 6、0.685 8,表明这些微卫星标记在黄鳝不同性别表型群体的遗传多态性发生了改变,它们可作为黄鳝遗传背景分析的分子标记.     

石斛属植物遗传多样性的RSAP分析（英文）

[目的]用RSAP标记技术分析中国境内分布的33种野生石斛的遗传多样性及亲缘关系。[方法]建立石斛RSAP-PCR反应体系,从45对RSAP引物中筛选出33对多态性引物,对33种野生石斛的基因组DNA进行PCR扩增。[结果]这33对引物共扩增出2 047条带,其中多态性条带为2 044条,多态性比例99.8%,平均每对引物产生61.9条多态性条带。材料间遗传相似系数变化范围为0.081-0.442,说明本实验所测试的材料具有较广的遗传基础。根据RSAP标记的结果,采用UPGMA法进行聚类分析,将33种野生石斛分为6类。结果表明剑叶石斛和滇桂石斛之间亲缘关系最近,而华石斛与喇叭唇石斛、细叶石斛之间亲缘关系最远。[结论]石斛具有丰富的遗传多样性,该研究可为石斛属的分类、育种及杂交亲本的选择提供分子水平依据。     

西双版纳野猪微卫星多态性研究*

 采用联合国粮农组织（FAO）和国际动物遗传学会（ISAG）联合推荐的27对微卫星DNA引物,对云南西双版纳野猪78个个体的遗传多样性进行了分析和研究,旨在为野猪遗传资源的合理利用及保护提供科学依据。结果表明：（1）78个个体在27个微卫星座位上共检出213个等位基因,各座位上等位基因数的范围在4～13之间,平均每个位点检测到789个等位基因,表明在3个野猪群体中多态性较丰富。（2）计算了等位基因频率,并以其为基础获得了野猪群体的平均杂合度、多态信息含量和有效等位基因数,分别为H均值0.81,PIC均值0.79;有效等位基因数共155.77个,有效等位基因数在2.65～10.10之间,平均数为5.77个,等位基因频率在0.0128～0.4808之间,其中位点SW72的102/等位基因频率最高,表明群体内的遗传变异较丰富。（3）计算了Nei氏标准遗传距离,结果表明景洪野猪与勐海野猪遗传距离最近,和勐腊野猪的遗传距离较远,种间内的遗传变异丰富,表明西双版纳野猪群体在核基因水平具有丰富的遗传多样性。     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2＋浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系（引物为中国鲎微卫星引物）.并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系：总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2＋2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件：模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.