优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgbM)与含有融合杀虫基因(GFMcryIA和CPTI)表达载体pGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体pGBIF4ABCVHB,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacum),经PCR及Southernblot检测,证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。Westernblot检测证实了vgbM基因的表达,杀虫实验表明,融合杀虫基因表达的毒蛋白具有杀虫活性,转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8%。表明VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达可使烟草可增产,又具抗虫性。     

优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达研究

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（VHb）基因与含有融合杀虫基因（GFMcryIA基因和CPTI基因的融合）表达载体PGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体PGBIF4ABCVHB，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了38株卡那霉素抗性转基因株，经PCR及Southern blotting检测，证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。western blot检测证实了VHb基因的表达,杀虫实验表明融合杀虫基因表达出的毒蛋白具有杀虫活性，转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8％。实验结果表明：VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达既可使烟草既可增产、又具抗虫性。     

人溶菌酶基因在烟草中的表达

根据植物偏爱的密码子，改变G＋C总量和密码子第三位碱基的G＋C含量，同时避免在真核表达中影响转录，翻译及mRNA稳定性的序列如AATTAAA和ATTTA，在原氨基酸序列不变的基础上，设计并合成了适合在植物中中高效表达的人溶菌酶(human lysozyme,简单HL）基因。构建了含HL基因的植物表达载体。用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导法将其转化烟草（Nicotiana tabacum).PCR和Western检测表明，HL基因在转基因烟草中得到整合和表达，提高了转基因烟草离体叶对野火病（Pseudomonas syringaepv.tabaci)的抗性。     

中棉光诱导基因Gacab 启动子的克隆及其功能分析

利用加接头法，从金华中棉(Gossypium arboreum)中分离获得了捕光叶绿素a／b蛋白复合体基因Gacab编码区5′上游的调控序列1009bp，命名为Gacab P，与公布的其它植物cab启动子序列比较，没有明显的同源性。将GacabP和197、504、779bp的5′端缺失体分别与gus(uid A)基因融合，构建植物表达载体。用Gacab P：：gus转化烟草(Nicotiana tabacum cv．NC89)，GUS组织化学分析发现Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达。在暗培养的转基因烟草叶片中Gacab P不表现活性，而光能够诱导gus基因的表达，表明Gacab P是一种光诱导型启动子。用基因枪轰击水稻愈伤组织，结果显示，Gacab P及3种不同长度的缺失体均可驱动gus基因的瞬时表达，以504bp的活性最高，瞬时表达水平明显高于35S启动子，197、779和1009bp的表达减弱，由此推测-197～-1bp为Gacab基因的基本启动子，-504～-197bp间包含正调控元件，-1009～-504bp间包含负调控元件。     

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA在烟草中的表达及其酶活性

摘要：将马铃薯(Solanum tuberosum )块茎特异蛋白patatin classⅠ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合，构建了植物表达载体pBSSP。用电激法将表达载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404，然后转化烟草(Nicotiana tabacum )叶片获得再生植株。经PCR、PCR-Southern、Northern杂交和蛋白质检测，证明patatin classⅠ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。酯酰水解酶（lipid acylhydrolase, LAH）活性分析显示，转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高。     

利用RNA沉默抑制子HC-Pro提高基因表达的策略

利用植物生物反应器生产药用蛋白具有独特的发展优势,但外源基因在受体内会发生基因沉默现象而影响基因的表达。由于基因沉默抑制子能有效抑制外源基因的沉默反应,本研究利用沉默抑制子蚜传辅助因子(helper component-proteinase,HC-Pro)转基因烟草有效提高了外源基因的表达。采用叶片注射法将携带表达载体p35S-30B-GFP的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)重悬液分别侵染野生型烟草(Nicotiana bentamiana)和HC-Pro转基因烟草(N.bentamiana),通过蛋白电泳检测和Western blot检测技术对绿色荧光蛋白(GFP)表达进行比较。研究结果表明,与野生型烟草Nb相比,HC-Pro转基因烟草中GFP的表达水平显著增加。本研究为基因沉默抑制子在植物生物反应器中的应用提供了理论依据。     

转nsLTPs类抗菌蛋白基因烟草对赤星病和青枯病的抗病性分析

以烟草叶盘为受体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将益母草 (Leonurus japonicus Houtt.) 非专一性脂转移蛋白(nsLTPs)类抗菌蛋白基因Lj-L和相应改造基因Lj-S分别导入烟草(Nicotiana tabacum cv. Xanthi.)，并进行抗病性分析。GUS染色和PCR分子验证表明外源基因已整合进烟草基因组中。RT-PCR分析表明，外源基因能够在烟草中稳定转录。T0代离体抗性实验表明，外源基因对烟草赤星病(Alternaria alternata)的抗性已达极显著水平; T1代活体抗性实验表明，Lj-L和Lj-S基因对青枯病(Pseudomanas solanacearum)的抗性也均达显著水平。抗性结果比较发现，Lj-L基因的抗病性效果优于Lj-S基因，且离体和活体抗病结果较一致，但并不与基因的转录水平成正比，似乎存在一个阈值。     

源于Cupriavidus campinensis BJ71的cctfdA基因的遗传转化提高烟草2,4-D抗性

高浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)是一种选择性除草剂,被广泛应用于防除阔叶杂草。为了避免2,4-D喷施过程中的喷雾和蒸发漂移,有必要提高敏感植物的2,4-D抗性。来源于微生物的2,4-D降解基因编码蛋白可以将其代谢而解除毒性。本研究以前期从2,4-D降解菌Cupriavidus campinensis BJ71菌株中克隆得到的2,4-D降解基因cctfdA为模板进行适合于烟草(Nicotiana tabacum)表达的密码子优化,利用改造后的基因Nt-cctfdA构建植物表达载体pSH737-Nt-cctfdA遗传转化烟草。结果表明,与野生型烟草及转化空载体的烟草相比,转Nt-cctfdA基因烟草的离体叶片及丛生芽的2,4-D抗性明显高于对照;转基因烟草植株可以抗10 000 mg/L浓度的2,4-D,而对照植株经350 mg/L浓度处理后死亡,表明转基因烟草的2,4-D抗性显著高于对照烟草30倍以上,且可以对抗10倍的2,4-D田间使用剂量。转基因烟草在2,4-D喷施前后,叶绿素含量基本无变化,而对照烟草的叶绿素含量明显降低。研究结果表明转基因烟草的2,4-D抗性显著提高,为进一步阐明转基因烟草的2,4-D抗性机理及2,4-D抗性转基因烟草的研发提供了基础资料。     

一个新的马铃薯patatin classⅠ基因的cDNA在烟草中的表达及其酶活性

将马铃薯(Solanum tuberosum)块茎特异蛋白patatin class Ⅰ基因cDNA与CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达载体pBSSP.用电激法将表达载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,然后转化烟草(Nicotiana tabacum)叶片获得再生植株.经PCR、PCR-Southem、Northern杂交和蛋白质检测,证明patatin class Ⅰ基因cDNA已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达.酯酰水解酶(lipid acylhydrolase,LAH)活性分析显示,转基因烟草植株的叶片中LAH活性明显提高.     

三个韧皮部特异性启动子在转基因烟草中表达的比较研究

用共整合的luc基因校正嵌合gus基因表达活性的方法对3个韧皮部组织特异性启动子在转基因烟草中的表达进行了比较，用杨树树皮储藏蛋白基因启动子（BP）、竹节花黄斑驳病毒启动子（CP）、笋瓜韧皮部蛋白2基因启动子（SP）以及CaMV35S启动子（35SP）构建了含有启动子-gus以及35SP-luc两类嵌合报告基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导法转化了烟草植株，GUS活性的组织化学定位结果表明，3个启动子皆驱动gus报告基因在转基因烟草的叶、叶柄和茎的韧皮部组织中特异地表达，BP和SP在烟草根部是组成型的，通过比较转基因植株的校正GUS活性，确定了3个启动子的相对活性为BP和CP的活性相近，而SP约为CP的84%，结果表明BP和SP是韧皮部组织特异性的强启动子。     

玉米花青素调节基因Lc对转基因烟草和矮牵牛花色的影响

利用PCR方法从油菜(Brassica napus)基因组中扩增得到花瓣特异性启动子XY355,构建该启动子与玉米(Zea mays)花青素调节基因Lc的植物表达载体pXY60。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将pXY60分别转化烟草(Nicotiana tabacum)和矮牵牛(Petunia hybrida)。对再生植株进行PCR检测,结果表明,外源基因已经整合到转基因烟草和矮牵牛的基因组中。观察发现,转基因植株的表型发生了明显变化:转基因烟草的花色由浅红变成了红色,转基因矮牵牛的花色由白色变成了浅紫色。     

向日葵种子特异性启动子Ha ds10G1的克隆及其功能验证

利用PCR技术从向日葵基因组DNA中克隆了Lea蛋白基因家族中Ha ds10 G1基因上游1414bp的调控序列，序列分析表明-1—1414bp与报道序列同源性为100%，将其与GUS基因融合构建植物表达载体后，通过农杆菌介导法转化烟草NC89，PCR扩增初步证明目的片段已整合到烟草基因组中，转基因植株的GUS活性检测表明，在茎、叶中无GUS活性，GUS活性只存在于种子中，因此，Ha ds10 G1启动子具有种子特异性的功能。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

狗蔷薇RcKN1基因的克隆及功能分析

Class-Ⅰ KNOX(KNOX1)基因是真核生物中高度保守的同源盒转录因子,在植物的器官和胚胎发生中起着重要作用。本研究从狗蔷薇(Rosa canina L.)的类原球茎中克隆出了其同源基因,通过对其编码的蛋白质序列比对和系统发育分析,认为其属于KNOX1 在狗蔷薇中的同源基因;该基因全长 1 509bp,其中编码区 1 185 bp,编码 395 个氨基酸,将其命名为 RcKN1 基因 (GenBank 登录号:JN998201)。RT-PCR分析表明,其在叶芽、花芽、类原球茎等幼嫩的器官中表达;进一步构建了组成型表达载体并导入烟草(Nicotiana tabacum L.)中分析其功能,转基因烟草出现了叶片浅裂、叶脉紊乱、叶片基部歪斜、叶片皱缩甚至类似于复叶的叶片等多种表型。研究结果表明,RcKN1 基因在植物发育中起着重要作用,是研究叶片发育机理和培育叶型奇特的花卉新品种有价值的目的基因。     

Leafy启动子控制下5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶基因(CP4EPSPS)的表达增强芽对草甘膦的抗性

抗草甘膦基因在转基因植物体内持续高效表达,不但增加植物代谢压力,有的甚至改变植物形态造成植物的生长发育畸形。为了减少转基因植株的代谢负担和能源浪费,从拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)基因组中克隆了Leafy组织特异性启动子替代CaMV35S启动子,用其驱动改造后加二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)小亚基引导肽的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)基因,同时调控报告基因gus的编码区构建植物表达载体p3300-Leafy-gus和p3300-Leafy-CP4EPSPS,嵌合基因经农杆菌(Agrobacterium)介导转化烟草。稳定表达后经GUS组织染色分析表明,Leafy驱动的gus表达仅局限在植物茎尖和幼叶部分,转基因植株成熟的叶片、茎部和根系均未能检测到GUS活性。草甘膦试验分析表明,Leafy驱动的CP4EPSPS的转基因植株幼芽部位有草甘膦抗性。结果表明,Leafy启动子驱动CP4EPSPS表达增强植株芽端对草甘膦的抗性。     

The Function of a Maize-Derived Phosphoenol pyruvate Carboxylase (PEPC) in Phosphorus-Deficient Transgenic Rice

Transgenic rice ( Oryza sativa L., a C₃ plant) lines carrying a complete phospho enol pyruvate carboxylase (PEPC) gene from maize (a C₄ plant) were tested for their performance in terms of organic acid synthesis and organic acid exudation into the rhizosphere under phosphorus (P)-deficient conditions. High PEPC activity increased the fraction of photosynthetically fixed carbon allocated to the organic acid pool, and P deficiency enhanced oxalate exudation from the roots of the transgenic plants. There was no evidence that the transformed PEPC was involved in internal P recycling in the plant. However, the root PEPC activity was positively correlated with the oxalate exudation and negatively correlated with the root P concentration, and a higher root PEPC activity led to a higher oxalate exudation. Thus, it is suggested that C₄-PEPC transgenic rice plants had acquired the ability to exude oxalate, which enhanced their capacity to adapt to low P soil conditions.     

Directed evolution of yeast ferric reductase to produce plants with tolerance to iron deficiency in alkaline soils

One of the most serious problems in agriculture worldwide is low iron (Fe) availability, due to high soil pH. About 30% of arable land is too alkaline for optimal crop production. Non-graminaceous and dicot plants, which use a reduction strategy to uptake Fe, suffer from Fe deficiency under these conditions, because the ferric chalets reductase in the root plasma membrane functions inefficiently at high pH. The refrel (reconstructed yeast ferric reductase) gene was subjected to random mutagenesis to obtain variants with high activity under high pH conditions. A mutant library was screened using a yeast in vivo assay system, and screens at pH 8.0 and 8.5 produced 10 candidates. In vivo ferric reductase activity was analyzed quantitatively. Yeast cells carrying the variant with the highest ferric reductase activity showed 6.0, 8.7, and 38 times greater activity at pH 8.0, 8.5, and 9.0, respectively, than did cells containing the original refrel gene. An amino acid substitution at position 312 was common to most of the high-activity variants. This substitution is believed to play an important role in the increased reductase activity at high pH. Interestingly, this mutation is near a hams-coordinating histidine co on, and the corresponding residue is probably located in the intramembranous region close to the cytoplasm. The variant gene with the highest reductase activity was introduced into tobacco, and transgenic tobacco carrying the gene showed enhanced tolerance to low Fe availability. This result should be useful in the engineering of non-graminaceous and dicot plants tolerant to Fe deficiency in alkaline soils.     

狗蔷薇RaWUS基因组成型表达对烟草叶片形态的影响

为验证从狗蔷薇类原球茎克隆的RaWUS基因的功能,构建了组成型表达载体,并用根瘤农杆菌介导的叶盘转化法对烟草进行了遗传转化。通过除草剂草丁膦筛选,获得了转基因植株并对其进行了表型观察和RT．PCR分析。结果显示转基因烟草叶片形态和叶脉表现出形态变化,包括叶片浅裂、叶片边缘波浪状、叶脉紊乱,甚至叶片的主脉上有不定芽的产生等。RT-PCR分析表明,RaWUS基因仅仅在经过草丁膦筛选的抗性转基因烟草中强烈表达,在野生型烟草中没有表达。表明RaWUS基因已经被成功转入烟草中,并可能通过改变激素的水平和调控维管束的发育来影响叶片形状。