2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较（英文）

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和Taq Man探针,构建分别包含PCV2 ORF1和ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于PCV2 ORF1和ORF2的Taq Man荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101copies/μl,ORF2方法可达1.0×102copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

猪感染类猪圆环病毒因子P1后血小板的变化

探讨类猪圆环病毒因子P1感染对广西巴马小型猪血小板参数的影响。将12头30日龄的广西巴马小型猪随机、平均分成两组．实验组经腹股沟淋巴结途径接种类猪圆环病毒因子P1的分子克隆。采用自动血液分析仪检测接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血血小板参数。统计分析显示猪感染P1后,与对照组相比。实验组的血小板平均体积（MPV）无显著差异,而血小板计数（PLT）和血小板压积（PCT）在接种后8d明显降低,血小板体积分布宽度（PDW）在接种后17d显著降低。     

类猪圆环病毒因子P1感染对猪红细胞的影响

探讨类猪圆环病毒因子P1感染后,广西巴马小型猪发生贫血的类型,推断贫血发生的原因。12头30日龄的猪随机分成两组,每组6头,试验组经腹股沟淋巴结途径接种P1分子克隆。采用自动血液分析仪对接种后3d、8d、17d、24d、31d及40d猪的外周血进行红细胞各参数检测。统计分析结果显示P1感染后,与对照组相比,红细胞参数之间无差异的指标有RBC、HGB、HCT、MCV和MCHC等5项,而MCH在接种后17d明显降低,而RDW在31d增高明显。可见,猪感染类猪圆环病毒因子P1可导致小细胞低血色素性贫血。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

猪圆环病毒2型组织培养特性研究

将经鉴定为PCV2阳性无菌处理的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代,PCV2病毒组织培养特性是添加D-氨基葡萄糖可有效地促进PCV2病毒的增殖复制,但病毒致细胞不产生病变,不能直接观察。应用PCR方法检测组织细胞培养物中的病毒增殖和增殖滴度,测定了PCV2病毒收获时间,试验表明PCV2病毒在PK15组织培养可连续传代,增殖病毒。     

猪圆环病毒2型ZZ株ORF1基因的扩增与测序

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV- 2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,对所测序列进行分析。结果显示,PCV-2 ORF1所表达的蛋白质具有良好的抗原性。     

一株类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定与分析

【目的】确定猪体内存在与猪圆环病毒2型核苷酸序列高度同源的因子。【方法】首先利用PCR方法对来自临床表现为猪断奶后多系统衰竭综合征的猪血清所抽提的DNA进行扩增,根据获得的序列再设计引物进行反向PCR,拼接得到类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列,最后根据P1全基因组序列设计引物扩增其全基因组加以验证。【结果】首次完成了类猪圆环病毒2型因子P1的全基因组序列测定。测序结果表明P1因子为环状DNA基因组,全长648个核苷酸,包括3个开放阅读框。除5′端16个核苷酸外,P1因子与国内猪圆环病毒2型BF毒株的核苷酸同源率为98.42%。系统进化分析表明P1与猪圆环病毒有很近的亲缘关系。【结论】猪体内存在类猪圆环病毒2型因子P1。     

猪圆环病毒2型分子生物学研究进展

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病因。目前流行的PCV2被分为PCV2a和PCV2b两个亚群。北美和其他国家PCVAD的暴发通常与主要基因型从PCV2a转变为PCV2b有关。本文对圆环病毒2型的分子结构及其表达产物的生物学活性的研究进展进行了综述,最后对分子差异和致病性进行了讨论。     

猪圆环病毒1型和2型四川分离株全基因克隆分析

参照Genbank收录猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)1、2型序列,设计两对特异性引物,分别扩增猪圆环病毒1型和2型四川分离株(PCV1-YA1株和PCV2-SC株)全基因组,获得了预期目标大小一致扩增产物,分别将其克隆于PMD18-T载体,分别命名为PMD18-T-PCV1-YA与PMD18-T-PCV2-SC。经酶切鉴定和序列测定证实,成功克隆了PCV1-YA1株1759bp和PCV2-SC株1767 bp的全基因组序列。所得序列与GenBank中的国内外其它PCV1和PCV2毒株进行比较分析,其同源性分别达到98.8%~99.9%与93.6%~98.6%;而PCV1-YA1株和PCV2-SC株之间的同源性则仅为69.2%,进一步分析两个毒株的主要阅读框架,毒株间ORF1核苷酸序列及推导的氨基酸同源性均为85.3%,而ORF2的核苷酸序列及推导的氨基酸同源性分别为66%和65.2%。推导显示两毒株之间ORF1编码产物疏水性区域分布有相似之处,而ORF2编码产物的跨膜区存在差异。     

猪流行性腹泻与猪圆环病毒2型混合感染的诊断与分析

猪流行性腹泻病毒是引起猪腹泻的主要病原,近几年来,国内猪流行性腹泻呈高发态势,山西省多个地区规模化猪场发生哺乳仔猪腹泻,死亡率高达80%～100%。猪圆环病毒2型是我国目前感染率最高的疫病,可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征,损害免疫系统,造成免疫抑制。山西省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室从各地规模化猪场采集因腹泻病死哺乳仔猪肠道内容物及肠系膜淋巴结各53份进行分子学检测诊断。结果发现,猪流行性腹泻病毒阳性率为90.6%;猪圆环病毒2型阳性率为69.8%。认为当前猪流行性腹泻严重发生与猪圆环病毒2型混合感染有密切关系。因此,在预防猪流行性腹泻的同时,要重视猪圆环病毒2型的免疫工作,并采取相关的综合防控措施,控制猪流行性腹泻的发生。     

猪圆环病毒2型贵州株ORF1基因的生物信息学分析

为了解猪圆环病毒2型贵州株(PCV2-GZ)ORF1基因的生物学特性,针对ORF1基因设计1对特异性引物,取PCV2阳性病料DNA为模板进行PCR扩增,克隆测序后进行生物信息学分析。结果表明:PCV2-GZ ORF1基因序列与GenBank登录的14株PCV2(06-06274,CC1,HUB-5,HUN-11,JX-1,LN-3,P710-1,PCV2HERD D,SC-10,SVP-321,SX-1,VOS 2689006,ZJ-38,N1)相应序列核苷酸的同源性为96.8%~99.7%,与国内HUB-5和ZJ-38的同源性最高,均为99.7%;PCV2-GZ编码的Rep蛋白与P710-1、HUB-5、SC-10、ZJ-38株的氨基酸序列同源性较高,均为99.4%。PCV2-GZ Rep蛋白可形成优势抗原表位,且不存在跨膜结构和信号肽,推测可进行PCV2 ORF1基因的全基因表达。     

猪圆环病毒2型HBZX株的全基因组克隆及序列分析

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)序列,设计合成了1对用于扩增PCV2全长基因组的特异性引物,从患断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的病料中,采用PCR方法克隆了PCV2 HBZX株的全长基因组序列,并进行了序列测定与分析.结果显示,PCV2 HBZX株的基因组全长为1 767nt:同源性比较发现,HBZX株与其他PCV2株的核苷酸同源性为95.0%～98.9%;遗传进化树分析表明,根据PCV2全基因组序列和ORF2编码蛋白的氨基酸序列所绘制的遗传进化树相似度较高;PCV2可分为两个亚型,以中国株为代表的亚洲株和以加拿大株为代表的美洲株分布在亚型1中,以法国株为代表的欧洲株分布在亚型2中.说明PCV2各分离株之间存在较为明显的地理位置上的相关性.     

猪2型圆环病毒ORF2基因片段的克隆与序列分析

利用ArrayDesigner2.0软件设计PCV2引物直接从PDNS病料肺组织中PCR扩增获得PCVCQB7基因片段,用pMD18-T载体连接、克隆获得PCVCQB7重组质粒。序列测定和与标准毒株对位比对分析PCVCQB7核苷酸序列全长624bp,系PCV2ORF2基因片段,与PCV2分离株的核苷酸序列相似性在80%以上,与PCV1在66%以下,采用最大似然法构建的系统发生树分析发现PCVCQB7位于PCV2主枝上,并与国内和欧洲分离株Imp.1147、304、375、QD、GD-TS、SH、24657_NL毒株亲缘关系较近形成一小分枝,表明PCVCQB7为引起PDNS的PCV2扩增产物。     

云南省猪圆环病毒2型遗传进化分析

【目的】调查猪圆环病毒2型（PCV2）在云南猪群和牛群中的流行情况,明确云南PCV2毒株的遗传变异、分子进化趋势。【方法】采用PCR方法对云南省11个地区783份猪、牛的血液、粪便等样品进行PCV2病原学检测,对6份PCV2阳性样品进行全基因组扩增、克隆与序列测定,利用DNAStar软件比对分析全基因和ORF2氨基酸序列,使用MEGA软件绘制遗传进化树。【结果】检测样品的PCV2阳性率为48.73%;共测得6株PCV2全基因组序列,其中5株为1 767 bp, 1株为1 768 bp;经遗传发育分析可知,有PCV2a亚型2株、PCV2b亚型2株、PCV2d亚型2株;6株PCV2毒株同源性在94.6%～99.9%之间,与GenBank数据库中20条参考株同源性在91.4%～99.8%之间;6株PCV2亚型的ORF2都有其典型的氨基酸位点,PCV2a毒株在第80(V80L)氨基酸位点突变为与PCV2(b/d)一致,PCV2b毒株在59(R59K)、63(K63R)、190(A190T)等氨基酸位点突变与PCV2d一致。【结论】PCV2在云南猪群中普遍存在,以PCV2a、PCV2b和PCV2...