家蚕正反交组合F1代的基因表达系列分析(SAGE)文库构建

家蚕杂交组合存在普遍的正反交遗传表型差异现象,为探讨引起正反交组合遗传差异的分子机制,构建家蚕品种75新×7532正交F1代雌雄个体和7532×75新反交F1代雌雄个体共4个基因表达系列分析(SAGE)文库。通过正反交组合同性别子代样本间的比较,显示低表达的标签在种类上占大多数,而高表达的标签在数量上占绝对优势。以错误检测率(FDR)≤0.001且拷贝数倍数差异在2倍以上作为比较样本筛选差异表达基因(DEGs)的条件,在7532×75新的雄性样本里面有298个上调基因和46个下调基因,而在雌性样本里有453个上调基因和240个下调基因。进一步对差异表达基因进行GO和KEGG路径功能分析,筛选出在显著性富集路径中的差异表达基因,其中参与新陈代谢途径、氧化磷酸化途径以及信号传导途径的差异基因在反交组合的子代中表达明显上调。     

应用基因表达系列分析(SAGE)技术研究高温处理前后家蚕的基因表达差异

高温对家蚕的生理和免疫能力有明显影响。为从分子水平上探究家蚕抗高温机制,应用基因表达系列分析(SAGE)技术获得家蚕5龄雌蚕高温处理前后中肠、丝腺和脂肪体组织的基因表达谱,构建高温组(34℃)和常温组(26℃)2个家蚕SAGE文库。2个家蚕SAGE文库分别包含3555107和3580976个原始标签,其中的标签种类分别为113684和131 296个,清洁标签的种类分别为45972和49467。比较2个文库清洁标签获得65 535种差异标签,共注释4249个基因,其中有1 062个差异表达的基因(P<0.05,错误检测率FDR≤0.001并且拷贝数的差异在2倍以上)。经GO分析发现2个文库中基因的分布极其相似,表明这些基因在不同的环境温度下有类似的生物学功能并参与类似的生理代谢过程。KEGG pathway分析显示有732个基因涉及176个KEGG路径,其中有40个为差异表达基因显著富集的路径(P<0.05),超过一半的路径与代谢、生物合成和信号传导有关。上述结果有助于对家蚕抗高温基因的鉴定以及探究基因调控的网络关系。     

分析基因差异表达的几种方法

随着人类和很多动物的基因组测序完成,以基因组功能研究为主要目标的后基因组时代的来临,基因功能信息的获取将成为基因研究的重点.基因差异表达分析是获取基因功能信息的重要方法.     

家蝇早期胚胎转基因前后的表达差异

以转基因处理的家蝇卵为对象，采用银染差异显示技术（DDPCR）．对携带绿色荧光蛋白（GFP）和抗菌肽（ABP）融合基因的真核表达质粒以电转移的方式进入家蝇受精卵后，卵内基因的表达情况做了初步研究。结果表明，转基因处理的蝇卵与未经转基因处理的蝇卵在分化开始之前基因的表达存在差异；以T11MA为锚定引物，在转基因处理组发现6条差异表达的片段，成功地克隆得到其中3夸。序列分析证实其中2条为新基因片段，另1条为家蝇细胞色素C的编码片段；斑点杂交证实了新基因片段仅在转基因处理组得到表达，而细胞色素C在2组中都有表达。获得的新基因片段登录于GenBank，登录号分别为AY030235和AY030236。本试验结果为解释外源基因在宿主细胞内的去向．发现宿主内部对目的基因整合和分解的相关因素提供了可能，并为系统地开展发育相关研究打下了基础。     

差异表达基因克隆技术的研究进展

随着基因组计划的顺利实施,大量的生物信息被解析,分离并克隆差异表达基因已成为生命科学研究的热点.近些年来,国内外学者发展了多种分析差异表达基因的技术.现就目前主要使用的一些技术作一综述.     

基因表达系列分析技术及其应用领域

基因表达系列分析(serial analysis gene express，SAGE)是近几年发展起来的一种快速分析基因表达信息的技术。它通过快速而详细地分析成千上万个EST(expressed sequencedtags)来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组表达信息。它不但能快速、详细地同时分析成千上万个基因转录子的丰富信息，还能发现新基因，因此是基因表达定性和定量研究的一种有效工具，     

草原红牛Acot2基因克隆及其在各组织中的表达差异研究

本研究旨在探究草原红牛酰基辅酶A硫酯酶2（Acot2）的基因功能，并对其进行生物信息学分析，检测Acot2基因在草原红牛不同组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Acot2基因序列（登录号：NM_001101938.1）设计引物，PCR扩增获得草原红牛Acot2基因的完整CDS并进行测序，利用分析软件进行序列同源性比对并构建系统进化树；获得对应的氨基酸序列并分析蛋白理化特性及蛋白亚细胞结构、亲疏水性和磷酸化位点，预测蛋白二级结构并构建蛋白质三级结构模型；利用实时荧光定量PCR方法检测Acot2基因在不同组织中的表达差异。结果显示，草原红牛Acot2基因CDS大小为1 395 bp，编码464个氨基酸，其核苷酸序列与亚洲水牛的同源性较高（98.3%），与猕猴和黑猩猩的同源性较低（80.5%和80.4%）。Acot2蛋白分子式为C₂₃₁₇H₃₆₀₆N₆₄₀O₆₂₈S₁₄，分子质量为50.924 ku，理论等电点为8.84。蛋白质不稳定指数为37.50，氨基酸残基多数为亲水性残基，总平均亲水性为-0.094。亚细胞定位分析表明，Acot2蛋白分布在内质网（30.4%）、线粒体（26.1%）、高尔基体（17.4%）、细胞质（17.4%）、液泡（4.3%）和细胞质（4.3%）中；磷酸化位点分析发现，Acot2蛋白存在20个磷酸化位点。二级结构主要形式有α-螺旋（21.8%）、β-转角（33.4%）、β-折叠（18.4%）和无规则卷曲（26.4%），三级结构预测结果与其相一致。实时荧光定量结果显示，Acot2基因在草原红牛胃中表达量最高，在肺脏中表达量极少。Acot2基因在生物进化过程中具有低保守性，其编码氨基酸组成的蛋白质结构稳定，属于水溶性蛋白，在线粒体和内质网中发挥作用，在草原红牛不同组织的表达量有明显差异。本研究结果为进一步探究Acot2基因对家畜脂代谢的影响和筛选草原红牛肉质候选基因提供资料。     

红三叶响应淹水胁迫的相关通路及差异表达基因分析

淹水胁迫是影响植物生长发育和分布的重要非生物胁迫，对植物淹水胁迫的研究是解决近年来极端强降水天气下植物生产管理的关键。红三叶作为优质豆科牧草，耐淹性较差，长期水淹会导致烂根死亡。为研究红三叶淹水胁迫下的分子响应机理，本研究通过Illumina高通量测序平台，以耐涝型品种“红龙”淹水胁迫下0、8和24 h三个时间点的幼苗叶片为材料进行转录组测序，将测序数据与参考基因组比对后进行差异表达基因（DEGs）分析和功能注释。结果显示，与对照0 h相比，“红龙”在淹水胁迫8 h后，有5065个DEGs，其中，上调表达基因2442个，下调表达基因2623个；在淹水胁迫24 h后，有9022个DEGs，其中，上调表达基因4279个，下调表达基因4743个。基因本体数据库富集结果显示，DEGs主要富集于代谢过程、细胞过程、生物调节、细胞、催化活性等条目；东京基因与基因组数据库富集结果显示，DEGs显著富集于植物激素信号调节、植物-病原互作、碳代谢和乙醛酸及二羧酸代谢等通路中，其中乙醛酸及二羧酸代谢通路中过氧化氢酶和甲酸脱氢酶等抗氧化酶相关基因高表达；并且发现差异表达的AP2/ERF、WRKY、bHLH、...     

福清山羊和戴云山羊夏季发情期卵巢组织比较转录组分析

试验旨在从分子遗传学角度探讨戴云山羊夏季维持较高繁殖力的遗传机制,从中发掘有用的遗传变异信息。利用转录组测序方法对福清山羊和戴云山羊夏季发情期卵巢组织进行研究,筛选品种间的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,利用基因本体（gene ontology,GO）、蛋白相邻类的聚簇（cluster of orthologous groups of proteins,COG）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库对筛选的差异表基因进行功能注释,并进行差异表达基因聚类分析,通过实时荧光定量PCR验证测序结果。结果显示,福清山羊和戴云山羊发情期卵巢的DEGs共357个,其中上调基因221个,下调基因136个。357个DEGs中的287个基因能够被GO数据库注释,78个DEGs能够被COG数据库注释,219个DEGs能够被KEGG数据库注释。KEGG数据库注释结果显示,这些差异基因显著富集的信号通路为蛋白消化吸收（protein digestion and absorption）、吞噬体（phagosome）、肺结核（tuberculosis）、胞外基质受体互作（ECM-receptor interaction）、金黄色葡萄球菌感染（Staphylococcus aureus infection）、同种异体移植物排斥（allograft rejection）等通路。经实时荧光定量PCR验证,所选基因（转录本）表达变化模式与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。本试验利用高通量测序获得大量山羊卵巢转录组信息,有助于从分子水平对山羊卵巢进行深入研究。     

草原红牛肝配蛋白A5基因克隆及其在不同组织中的表达研究

研究旨在克隆中国草原红牛肝配蛋白A5（ephrin A5，EFNA5）基因，并对其进行生物信息学分析，检测EFNA5基因在中国草原红牛不同组织中表达的差异。以中国草原红牛为研究对象，根据GenBank公布的牛EFNA5基因序列（登录号：NM_001076432.1）设计引物，PCR扩增获得EFNA5基因的完整编码区（CDS）序列后进行测序验证，利用分析软件进行序列相似性比对并构建系统进化树；分析对应的氨基酸序列蛋白理化特性并预测蛋白亚细胞定位、蛋白亲/疏水性和磷酸化位点；预测蛋白二级结构并构建蛋白三级结构模型；以实时荧光定量PCR法检测EFNA5基因在中国草原红牛各组织中的相对表达量。结果显示：中国草原红牛EFNA5基因与普通牛和美洲野牛相似性最高，分别为100%和99.8%，与羊、人的相似性分别为95.6%、97.2%，与海豚、鸡、马、猕猴、小鼠和猪的相似性较低，分别为83.6%、85.8%、84.5%、84.9%、84.1%、82.8%；EFNA5基因CDS大小为687 bp，编码228个氨基酸，EFNA5基因编码蛋白的分子式为C₁₁₈₃H₁₇₉₁N₃₁₅O₃₃₉S₁₃，总原子数为3 641，分子质量为26.266 ku，理论等电点为5.97，不稳定系数为49.66，总平均亲水性为-0.313。磷酸化位点预测分析发现，EFNA5蛋白共有27个磷酸化位点；亚细胞定位结果表明，EFNA5蛋白主要位于细胞质（26.1%）、分泌系统囊泡（27.1%）、细胞核（13.0%）、线粒体（13.0%）、质膜（8.7%）、内质网（4.3%）、高尔基体（4.3%）、细胞骨架（4.3%）及液泡（4.3%）中；二级结构主要由α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲组成，分别占18.9%、30.2%、26.4%和24.5%，与三级结构预测结果相符；EFNA5基因在中国草原红牛不同组织的相对表达量差异较大，在肾脏和胃组织中表达量较高，在肺脏组织中表达量最少。本研究结果可为进一步筛选草原红牛肉质候选基因提供参考。     

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf9细胞中的表达

对人胰岛素基因真核表达载体（pCMA／mINS）进行Xho I酶切，回收的含人胰岛素基因组基因的1608bp片段与线性化的杆状病载体pFast Bac I进行连接，获得重组载体pFast/mINS。将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌，在体内进行重组，并经2次抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组载体Bacmid/mINS。将该载体转染Sf9细胞，获得了重组杆状病毒，经Tricine-SDS-PAGE和Western-blotting检测，重组杆状病毒在Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原，而细胞培养上清中未检测到胰岛素和胰岛素原。     

日本血吸虫信号转导蛋白sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因，并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明，该基因为日本血吸虫新基因，完整开放阅读框（ORF）长1896bp，编码631个氨基酸，理论分子质量为73．3ku。该基因编码的氨基酸序列具有wnt家族蛋白的典型特征，与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26％，推测为血吸虫的Wnt10a基因，命名为Sjwnt10a（GenBanK登录号DQ643829）。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况，结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高，在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达，但分别仅为19日龄童虫表达量的8．8％和5．0％，而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示，童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

基因组，基因表达与饲料

（接《新饲料》2008年第8期16页） 8 环境的作用 基因型的固有性质是不依赖于环境的，它是每种动物的基本特征。基因组由成千上万的基因组成，这些基因特定的时空表达是动物生长发育、维持健康和避免疾病等正常过程的指挥棒。然而，基因型的表达不可避免地受到环境的影响。     

利用RNA-seq技术筛选影响文昌鸡腹脂沉积的重要候选基因

本研究利用RNA-seq技术筛选影响文昌鸡腹脂沉积的重要候选基因，旨在为低脂文昌鸡的分子育种提供理论依据。本研究结果显示，共有15 996个基因在文昌鸡腹部脂肪组织中表达，16 926个基因在儋州鸡腹部脂肪组织中表达，15 580个基因在文昌鸡和儋州鸡腹部脂肪组织中均有表达，95个基因在文昌鸡和儋州鸡腹部脂肪组织中差异表达。GO富集分析结果显示差异表达基因显著富集在细胞过程、分子活性物质运输等过程（P<0.05）。KEGG富集分析结果显示，差异表达基因在PPAR信号通路、TGF-β信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成等途径富集。通过筛选与验证，最后确定SCD、SMOC1、IGFBP2、MSMB基因为影响文昌鸡腹脂沉积的重要候选基因。     

用银染mRNA差异显示技术寻找不同生长阶段绵羊皮肤中差异表达基因

利用优化了的银染mRNA差异显示技术(DD-PCR)，比较了出生后40日龄、60日龄和120日龄三个不同生长阶段的绵羊相同部位的皮肤中总RNA的差异表达。结果表明：同一个体不同日龄的绵羊存在着表达量不同的差异表达基因，并初步筛选出了8条重复性好的差异cDNA片段，其中1条表达量不同的差异片段存在于40日龄，5条存在于60日龄，2条为120日龄所特有。本试验将为进一步研究影响绵羊毛性状相关基因在皮肤中的表达提供科学的参考依据。     

抑制消减杂交技术及其在动物繁育研究中的应用

基因是染色体上具有一定座位的遗传单位.基因表型克隆法是以mRNA为起始材料,利用RT-PCR和接头技术,对差异显示的基因条带进行回收后作探针,在cDNA或基因组DNA文库中筛选新基因.这方面发展起来的新技术主要有：cDNA差式分析法（RDA）、标签接头竞争PCR技术（ATAC-PCR）、抑制消减杂交法（SSH）、基因表达连续分析法（SAGE）、cDNA3＇端限制酶切片段显示法（RFD）等,这些技术省去了分子标记定位分析的繁琐程序,并同时能分离多个未知产物的差异表达基因.其中,抑制性消减杂交技术是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术,具有检测的特殊性,在动物和人类的生殖和发育领域广泛应用.     

通过比较转录组分析鉴定山麻鸭开产调控基因

蛋鸭开产与卵巢发育有紧密联系，本实验旨在探索山麻鸭开产前后卵巢形态变化及基因表达的差异，鉴别参与启动开产的关键基因，为后期蛋鸭开产相关的分子遗传机制研究奠定基础。在山麻鸭开产前后的S1期（81日龄）和S2期（137日龄）分别选取3个个体的卵巢基质进行转录组测序，对转录组数据开展差异表达分析、功能富集分析及关键基因筛选，同时对关键基因进行荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。在差异倍数log2转换的绝对值（|log2(FoldChange)|）大于1.5、矫正P值<0.05的筛选条件下鉴别出382个差异表达基因。基于382个差异表达基因的GO功能注释发现与卵泡生长和卵巢功能调节相关的通路：细胞外基质的组织、细胞外基质结构成分和含有胶原蛋白的细胞外基质相关途径；KEGG富集分析发现上述基因显著富集于ECM受体相互作用和PI3K-Akt信号通路。在涉及上述重要富集通路的基因中有9个基因交集：CD44、COL1A1、COL6A1、CREB3L1、ITGB2、THBS2、VWF、VEGFC、WNT5B，通过qRT-PCR验证了这9个基因在转录组数据差异表达方面的可靠性。在这9个基因中，CO...     

鸡毒支原体MG-HY株感染鸡气管的转录组学分析

旨在进一步探究鸡毒支原体（MG）感染SPF雏鸡后气管基因组转录水平的变化,筛选出MG感染后参与气管黏膜炎性损伤的差异表达基因和调控通路。使用MG-HY株菌液按0.2 mL·羽^-1经点眼滴鼻感染SPF雏鸡,感染后收集气管组织利用RNA-Seq技术进行测序分析。转录组分析结果显示,在MG感染期间RNA-seq共筛选出3 112个显著（P<0.01）差异表达基因（DEGs）,其中,1 646个上调基因,1 466个下调基因。GO功能分析显示,差异基因主要涉及生物调节、刺激的反应、多细胞生物过程、细胞成分组织或生物发生等生物过程。KEGG-Pathway分析发现差异基因参与黏膜免疫信号传导通路,例如：细胞因子-细胞因子受体相互作用,细胞黏附分子（CAMs）,细胞外基质（ECM）受体相互作用、紧密连接、PPAR信号通路和MAPK信号通路等,表明这些基因参与了MG诱导的雏鸡气管炎症反应和损伤。使用qRT-PCR验证与黏膜免疫相关的13个差异表达的基因,其结果与转录组分析一致。本研究为进一步阐明MG感染导致宿主气管黏膜上皮损伤和黏膜免疫机制提供了基础。     

全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析

紫花苜蓿是世界最重要的豆科牧草之一，干旱是影响其产量和地理分布的关键瓶颈。在紫花苜蓿响应干旱胁迫过程中，转录因子发挥着重要的调控作用。TCP（teosinte branchesd 1/cycloidea/pro-liferating cell factors）为植物特有的转录因子，在植物生长、发育、响应逆境胁迫中都具有重要的生物学功能。截至目前，该基因家族在紫花苜蓿中的分布以及响应干旱胁迫的生物学功能仍未见报道。因此，为进一步挖掘紫花苜蓿中响应干旱胁迫功能基因，本研究利用生物信息学方法在全基因组水平对TCP基因家族进行了鉴定，并对其系统进化、基因结构、染色体定位、共线性分析以及干旱胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明，紫花苜蓿基因组中共鉴定出40个MsTCP基因，不均匀地分布于20条染色体上，其中包括17对旁系同源基因对，且都是基因片段复制事件。系统发育和保守结构域分析发现，MsTCP基因可以分为2个大分支和3个亚家族（PCF， CIN与CYC/TB1），同一分支中的成员具有相同氨基酸数目的TCP结构域，同亚家族中的成员具有相似的保守基序与基因结构。此外，通过分析紫花苜蓿响应干旱转录组数据共鉴定出4个可能与紫花苜蓿响应干旱胁迫有关的MsTCP基因（MsTCP23，MsTCP27，MsTCP29，MsTCP33）。qRT-PCR结果进一步表明PEG模拟干旱胁迫处理后，这4个基因的表达量在根和叶中均显著上调，进一步确定了这些基因的确响应紫花苜蓿干旱胁迫。该研究为后期深入解析紫花苜蓿响应干旱胁迫理论以及通过基因工程技术创制高抗旱紫花苜蓿新种质奠定基础。