鲤鱼基因组同源框Hoxa3a序列同源性分析与分子进化研究

本文利用生物信息学软件分析了鲤（Cyprinus carpio）基因组中同源框基因Hoxa3a与多种鱼类及其它生物的同源性,构建了分子进化树。结果表明：鲤与斑马鱼（Danio rerio）的序列同源性最高为95%,与大西洋鲑（Salmo salar）等四种鱼类的同源性次之为84%,与米氏叶吻银鲛（Callorhinch...     

奥利亚罗非鱼线粒体基因组全序列测定与系统进化分析

采用LA-PCR(long amplification polymerase chain reaction)扩增方法获得奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)线粒体基因组全序列.分析表明,序列全长16 632 bp,包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个长度为931 bp的主非编码区.A、T、G、C碱基的组成分别为27.89％、25.50％、15.62％、30.99％.基因排列与罗非鱼属的其他物种一致.13个蛋白质基因除COX1用TGT做起始密码子外,其他均以ATG为起始,终止密码子除COX2、Cyt b、ND4为不完整的T,其余基因均以典型的TAA做终止密码子.22个tRNA的二级结构都具有典型三叶草结构.系统发育分析显示,罗非鱼属与丽鱼科(Cichlidae)其他物种分开,聚为单系群,其中奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,莫桑比克非鱼和罗非鱼KM-2006亲缘关系较近.本研究旨在为进一步利用线粒体基因组分析罗非鱼群体遗传多样性、亲缘关系以及丽鱼科系统进化提供基础依据.     

传染性造血器官坏死病毒Sn1203株全基因组序列及系统进化分析

本课题组于2012年从中国东部的虹鳟鱼养殖场分离得到了严重威胁我国鲑鳟鱼养殖的传染性造血器官坏死病毒(IHNV)IHNV-Sn1203病毒株。根据GenBank中收录的IHNV病毒株的序列设计引物,将IHNV-Sn1203基因组序列分成5个片段进行RT-PCR克隆,最终得到完整的IHNV-Sn1203基因组序列。利用Lasergene和MEGA 5.0软件分析了IHNV-Sn1203株的全基因组序列、基因组编码蛋白、基因组末端和未翻译序列、以及病毒基因同源性和系统发育。结果发现,IHNV-Sn1203基因组全长11131nts,共编码6个病毒蛋白,大小分别为核蛋白(N)1176nts、磷蛋白(P)693nts、基质蛋白(M)588nts、表面糖蛋白(G)1527nts、聚合酶蛋白(L)5961nts和非结构蛋白(NV)336nts。IHNV-Sn1203株各基因间均具有保守的基因终止序列(Gene end,GE)、基因间序列(Intergenic regions,IG)、基因起始序列(Gene star,GS)及Kozak序列,以确保病毒基因的转录和翻译效率。系统进化分析发现,IHNV分为E、U、M、L和J共5个基因型,其中IHNV-Sn1203株与中国其他IHNV株具有显著的亲缘关系,属于J基因型中的J Nagano亚型。由G基因的进化分析发现,J基因型的病毒与U基因型亲缘关系最近,推测IHNV病毒最初可能通过进口鱼卵的方式由U基因型引入,随时间的推移逐渐进化为J基因型。     

大弹涂鱼TLR基因分子进化研究及其在鳗弧菌胁迫后的表达分析

大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种生活在潮间带的淤泥滩和红树林等两栖环境中的鱼类,其免疫系统面临比水生生活更大的选择压力。Toll样受体基因(简称TLR)是重要的先天免疫成员,一直是鱼类分子免疫学的研究热点之一。为了探究大弹涂鱼TLR基因是否因为其独特的生活环境而产生适应性进化以及其TLR基因在受到细菌攻击后的免疫应答模式,本研究从大弹涂鱼皮肤转录组中获得了TLR5, TLR8和TLR9完整序列以及TLR3和TLR7部分序列,采用分子生物信息学对大弹涂鱼TLR5, TLR8和TLR9基因序列以及氨基酸序列进行了分析,并根据所构建的系统发育树对5个TLR基因进行了分子进化分析,采用荧光定量PCR方法对大弹涂鱼5个TLR基因的组织表达分布和鳗弧菌攻击后5个TLR基因的免疫应答模式开展了研究。结果显示, TLR5基因全长3071 bp,包括长度为2646 bp的编码区,共编码882个氨基酸;TLR8基因全长3175 bp,包括长度为3033 bp的编码区,共编码1011个氨基酸;TLR9基因全长3398 bp,编码区长度为3093 bp,共编码1031个氨基酸。大弹涂鱼3个TLR基因与其他物种的TLR基因结构相似,具有高度保守性。位点模型结果表明,鱼类TLR3, TLR5和TLR8是高度保守的,而TLR7和TLR9在长期进化过程中产生了适应性进化;而进化枝-位点模型结果表明,为了适应更加复杂多变的两栖环境,大弹涂鱼TLR9基因可能产生了适应性进化。大弹涂鱼5个TLR基因在8个健康组织(肠,眼,肾,肝,脑,肌肉,脾和皮肤)中均有表达,在肝脏和脾脏中的表达量较高。在受到鳗弧菌(Vibrio anguillarum)攻击后的免疫表达模式表明了大弹涂鱼5个TLR基因在应对细菌入侵时起到了重要作用。     

麦鱼线粒体基因组序列测定与结构特征分析

通过PCR扩增和一代测序技术获得麦鱼(Rhinogobius sp.)线粒体基因组全序列,并对其序列结构进行了分析。结果表明：1)麦鱼线粒体基因组全长16 511 bp,其碱基G+C的含量为47.7%,A+T的含量为52.3%,呈现AT偏好性;2)共含有蛋白质编码基因13个,rRNA基因2个,tRNA基因22个和D-loop区,除ND6、tRNA-Gln、tRNA-Tyr、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Ser、tRNA-Glu、tRNA-Pro基因在L链上编码之外,其他基因均在H链上进行编码;3)基于线粒体基因组全序列和Cytb基因,分别构建了鰕虎鱼类中部分属的进化树,其表明麦鱼与波氏吻鰕虎鱼、褐吻鰕虎鱼、子陵吻鰕虎鱼聚在一个分支上,均属于吻鰕虎鱼属,并且其与波氏吻鰕虎鱼的亲缘关系最近。     

基于12SrRNA序列研究龟鳖类的系统进化特征

为研究龟鳖类的系统进化关系,以期为龟鳖类的保护和合理开发利用提供基础资料,测定了15种龟类线粒体12SrRNA基因片段的序列。比对后获得一致序列长为433 bp,有191个变异位点,总变异率为43.2%,其中简约信息位点108个。A、T、G、C的平均含量分别为21.46%、34.42%、25.85%和18.27%。A+T含量(55.9%)高于G+C含量(44.2%)。在433个核苷酸位点中,有插入/缺失35个,转换为34,颠换为21,转换/颠换比率为1.67。与NCBI上其它一些龟鳖的序列进行比对后,得到414 bp的一致序列,其中236个为变异位点,总变异率为57.00%;简约信息位点181个。A、T、G、C的平均含量分别为35.7%、22.2%、18.1%、24.0%。A+T含量(57.9%)高于G+C含量(42.1%)。在414个核苷酸位点中,转换为30,颠换为14,转换/颠换比率为2.12。基于Kimura双参数模型分析龟鳖类种间、属间、科间遗传距离,并用邻接法构建分子系统树。结果显示:7种闭壳龟种间差异在0~0.043,平均为0.022;淡水龟科属间遗传距离为0.007~0.140,平均为0.074;曲颈龟亚目9个科间(不包括平胸龟)遗传距离为0.055~0.197,平均为0.139。由此认为,淡水龟科与陆龟科亲缘关系比龟科更近;不支持将闭壳龟属拆分为闭壳龟属和盒龟属;支持将平胸龟属归为鳄龟科的一个属。     

基于COⅡ基因序列的中国近海12种蛸亚科动物的分子系统进化研究

为探讨我国近海蛸亚科(Octopodinae)动物的系统进化关系,本研究通过PCR扩增得到了东海区蛸亚科2属12种蛸类的线粒体COⅡ基因部分序列。纯化后测序,利用多个生物软件对序列变异和碱基组成进行分析。Kimura双参数法计算遗传距离,并结合GenBank上相关头足类同源序列构建NJ、UPGMA系统树。结果表明,蛸类COⅡ基因符合一般线粒体基因A+T含量较高的特点,有较为明显的反G偏倚。其变异位点较多的集中在第三位,编码的氨基酸序列变异位点较少。遗传距离分析表明,所得物种的遗传距离介于0.000与0.232 3之间,且大多位于0.140 0~0.200 0之间。聚类分析表明,所研究蛸类被明显地聚为两大类,即以真蛸为代表的长腕类和以砂蛸为代表的短腕类,证明了蛸属的非单系性。探讨了部分蛸类的分类地位,并就COⅡ基因在头足类系统进化研究的应用潜力进行了剖析。     

新功能基因的识别与验证-PDCD5猪同源基因的电子克隆与Ontology分析

<正>随着生命科学的发展,"人类基因组计划"大规模测序工作的完成,新基因的搜寻和蛋白功能分析成为研究的热点。在本实验中,我们以人的PDCD5序列(NM-004708)为线索,经过Blast,EST支持情况,拼接得到猪的同源序列,nr查新,多物种EST数据库支持分析.     

帚状江蓠质体UPA和线粒体COⅠ基因的序列比较及其系统进化分析

为研究海南省帚状江蓠(Gracilaria edulis)野生群体的种质资源、遗传多样性状况及红藻门物种间亲缘关系,采集海南省文昌和莺歌海潮间带的野生帚状江蓠,采用PCR扩增获得帚状江蓠质体UPA基因片段(质体23S rRNA V区域)和线粒体COⅠ基因片段,分别对其进行序列比较及系统进化分析。结果表明,UPA基因片段T、C、A、G的含量分别为26.2%、16.2%、30.3%、27.3%;COⅠ基因片段T、C、A、G的含量分别为39.2%、15.1%、27.6%、18.1%;UPA和COⅠ基因片段的A+T的平均含量分别为56.5%和66.8%。UPA基因片段长度为370 bp,共检测出1种单倍型,无多态性位点;COⅠ基因片段长度为664 bp,共检测出2种单倍型,3个多态性位点,均为简约信息位点。与UPA基因相比,COⅠ基因具有更高的变异度,更适合用于帚状江蓠遗传多样性的分析。基于UPA和COⅠ基因片段对帚状江蓠进行系统进化分析,两者结果一致,结合形态学分析表明,帚状江蓠应是江蓠属内独立的分支。     

基于microCT扫描技术的鲤骨骼和显微结构分析

了解活体鲤（Cyprinuscarpio）骨结构、形态、连接、空间分布以及骨骼矿物质组成对鲤的选育、行为学研究以及肉品加工有重要的意义。X射线显微CT技术（microCT）对样品没有破坏,可实现活体检测,并能获取活体任意形态的结构参数。因此,文章通过这项技术来研究活体鲤的骨骼状况。结果显示,脊椎骨与头、尾相连,胸鳍位于头骨后,背鳍、腹鳍和尾鳍与整个脊椎骨并不相连。骨体积分数和骨小梁厚度在腹鳍较高,头尾较低;骨表面积体积比、骨小梁数量和骨小梁间隔在头部较高,腹鳍较低;骨矿物质含量、骨矿物质密度和组织矿物质含量在背鳍最高;骨体积分数在腹鳍最高,胸鳍、背鳍和尾鳍次之,头尾较低。骨小梁厚度、矿物质含量等在背鳍、腹鳍部位较高,这可能与鲤的运动有关,而头骨表面积体积比、骨小梁数量和骨小梁间隔较高可能与头部的复杂结构密切相关。     

分子群体遗传学方法处理鲤形态学数据的适用性

在鱼类形态学性状的数据处理分析中,主要利用数理统计分析软件进行形态学数据的聚类分析、主成分分析和判别分析,而随着现代分子生物学技术的发展,一系列分子群体遗传学数据分析方法和处理软件应运而生。为研究分子群体遗传学方法对鱼类形态学数据分析的适用性,实验以兴国红鲤、玻璃红鲤、荷包红鲤完全双列杂交产生的9个群体形态学数据为对象,比较了传统形态学方法与分子群体遗传学方法对鱼类形态学性状的分析效果。结果发现,两类方法的聚类分析结果一致;主成分分析的结果表明,传统形态学分析方法能反映个体间的形态差异,而分子群体遗传学方法则能更好地反映群体间的形态差异;判别分析结果显示,两类方法的综合判别率相当;利用STRUCTURE软件进行的遗传聚类分析结果也发现,两类方法所得的结果一致。研究表明,应用传统形态学方法与分子群体遗传学方法分析鲤形态学性状是一致的,分子群体遗传学方法处理鲤科鱼类形态学数据是可行的。     

Development and evaluation of a high‐throughput single nucleotide polymorphism multiplex assay for assigning pedigrees in common carp

Accurate pedigree information is critical when managing animal breeding programmes and ensure the highest rate of genetic gain. The abundance of available genomic data and the development of high‐throughput genotyping platforms have facilitated the use of single nucleotide polymorphisms (SNPs) as the best DNA markers for genomic selection studies. Furthermore, the superior qualities of SNPs compared with those of microsatellite markers allow standardization between laboratories, which is crucial for developing an international set of markers for use in traceability studies. The objective of this study was to develop a high‐throughput SNP array to assign common carp pedigrees accurately. A 48‐SNP array was developed based on the Fluidigm genotyping platform, and a phylogenetic analysis was performed to distinguish different pedigrees. A likelihood‐based approach was used to infer parental pairs, and the pair with the highest LOD score (log of the ratio of the likelihood given parentage to likelihood given non‐parentage) was assigned. The SNP genotypes of the offspring and candidate parents tested were collected, and 94% of the offspring were assigned to the most‐likely parent pair, which was consistent with the actual pedigree records. Using this SNP assay will allow implementation of offspring testing at large commercial farms where improved accuracy of pedigree assignments and genetic evaluations will increase genetic gains in the common carp aquaculture industry.     

用RAPD方法研究草鱼、柏氏鲤和3个地理种群鲤的亲缘关系

用２４种随机引物对雅罗鱼亚科（Ｌｅｕｃｉｓｃｉｎａｅ）的草鱼,鲤亚科（Ｃｙｐｒｉｎｉｎａｅ）的柏氏鲤和３个地理种群鲤（荷包红鲤、黑龙江野鲤和德国镜鲤）进行ＲＡＰＤ分析,构建了这５种鱼类的基因组指纹图谱。通过对获得的基因组指纹图谱的量化分析,利用ＵＰＧＭＡ重建了它们之间的亲缘关系。结果鲤种内３个地理种群之间的相似性高于鲤和柏氏鲤种间的相似性,而草鱼与另４种鲤亚科鱼类亚科之间的差异明显高于柏氏鲤、黑龙     

斑马鱼微卫星分子标记检测鲤鱼种间多态性

用6072对斑马鱼（Danio rerio）微卫星引物对黑龙江鲤（Cyprinus carpio haematopterus Temminck et Schlegel）、荷包红鲤（Cyprinus carpio var．wuyuanensis）和柏氏鲤（Cyprinus pellegrini Tchang）进行种间遗传差异分析，共发现563个斑马鱼微卫星标记在鲤鱼种间表现出多态性。从中随机抽选25个标记，对斑马伍和3种鲤鱼的遗传多样性进行分析，使用Phylip3．63软件按照Nei氏标准遗传距离计算种间遗传距离，再用MEGA3．0软件绘制NJ系统发生树，并进行1000次bootstrap检验系统树。结果显示，黑龙江鲤与荷包红鲤首先聚类，然后是柏氏鲤、斑马鱼。这些具有多态性的斑马鱼微卫星标记可用于鲤鱼种间种质鉴定，同时，借用模式生物斑马鱼的丰富遗传标记资源，增加同科的鲤鱼遗传连锁图谱上遗传标记的密度，必将对鲤鱼遗传育种进入分子育种时代起到促进作用。     

金属硫蛋白基因对转基因鲤及实验动物体内重金属累积的影响

金属硫蛋白(metallothiontine,简称MT),又称重金属结合蛋白,是一种低分子量富含半胱氨酸的金属结合蛋白。锌、铜、镉等多种金属元素均可在体外或体内诱导组织MT大量合成。已有研究表明,MT在微量元素代谢、重金属富集、环境污染的清除等方面起重要作用,因此, 选择恰当的启动子是保证外源基因在转基因鱼中成功表达的最重要因素。在转基因鱼的研究过程中,使用的转基因材料从最初阶段的人及其它哺乳类如牛、羊等的生长激素基因发展到现在的鱼的生长激素基因,启动调控顺序也由小鼠的重金属螯合蛋白(MT-1)基因发展到鱼的重金属结合蛋白基因,如虹鳟金属硫蛋白基因、鲤β-肌动蛋白基因、美洲鲽抗冻蛋白基因以及鲤金属硫蛋白     

鲤WISP基因家族的克隆、表达及系统进化树的构建

Wnt1诱导分泌蛋白(WISP)基因家族与CYR61、CTGF、NOV基因共同构成了CCN家族。研究通过鲤基因组序列与斑马鱼WISP基因编码区全序列的比对获得WISP1a、WISP1b、WISP2、和WISP3等4条序列。经过克隆、测序、比对拼接得到其开放阅读框,分别是1 089、1 077、1 038和1 026 bp,它们都是由5个外显子和4个内含子构成,分别编码362、358、345和341个氨基酸。分子系统学分析表明,鲤4个WISP基因具有高度同源性,其中WISP1a、WISP1b和WISP2均含有4个模块,WISP3缺少第2个模块。通过RT-PCR检测WISP基因在鲤组织中的表达,结果表明,WISP1a鲤在13个组织中均有表达,皮肤中表达最高,脾、肠、卵巢次之,其他组织中表达较低。WISP1b在精巢、脑、皮肤、卵巢中表达较高。WISP2在血液、鳃中表达较高。WISP3在血液、脑、肝中表达较高。实时荧光定量PCR法分析WISP基因在鲤胚胎发育时期的表达,结果表明,除WISP3外,WISP1a、WISP1b和WISP2在前期表达较高,36 h表达最低,随后逐渐升高至第6天开始下降。     

磁珠富集法与小片段克隆法筛选鲤微卫星的比较研究

用2种方法克隆黑龙江鲤(Cyprinus(Cyprinus)carpio haonatopterus)的微卫星序列。这2种方法分别是：①经典的小片段DNA克隆库,用末端标记的[γ^-32]ATP的CA重复序列为探针筛选;②将酶切获得的小片段DNA用结合有磁珠的并连接有15个CA重复序列的生物素进行富集,获得的含有CA重复的DNA片段并经过两次PCR扩增再克隆的方法获得富集微卫星片段的克隆库。从前一个方法的克隆库中筛选2000个菌落,获得阳性克隆45个,有22个含有微卫星,完美型的占63．6％,非完美型的占22．7％,混合型的占13．7％,重复次数超过10的有9个,占40．9％;从方法②的克隆库中筛选2600个菌落,获得阳性克隆1300个,测序其中的390个克隆,微卫星314个,完美型的占79．0％;非完美型的占14．3％;混合型的占6．7％,重复次数超过10的有293个,占93．3％。结果表明,用生物素结合磁珠富集法克隆微卫星效率高,成本低,所获微卫星质量高,是一种值得推荐的微卫星制备方法。     

津鲢与长江鲢遗传多样性分析

随机选取津鲢和长江鲢各36尾,用16个微卫星标记进行遗传多样性分析。结果显示:16个微卫星位点在2个群体中共检测到等位基因105个,基因型241种,每个位点等位基因数3～15个,平均6.6个,基因型4～37种,平均15.1种。2个鲢群体平均观察杂合度(Ho)分别为0.5393和0.5392,平均期望杂合度(He)分别为0.5887和0.5762,结果表明该2个鲢群体遗传多样性水平较高。2个鲢群体平均多态信息含量(PIC)分别为0.5602和0.54,固定系数(FIS)表明这2个鲢群体表现为杂合子缺乏(FIS0)。2个鲢群体之间的遗传距离为0.0566,平均遗传分化系数(Fst)值为0.021,说明仅有2.1%的遗传变异来源于群体间。