甘蓝非编码RNA基因BoNR1的克隆与表达分析

非编码RNA是近年来新发现的一类在生物体内广泛存在、能够在生命活动中行使重要功能的特殊基因。根据普通白菜花粉特异的非编码RNA基因BcMF11的全长序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从甘蓝中克隆出BcMF11的同源基因BoNR1,该基因全长798bp,缺乏明显的开放阅读框,而且在序列中多处出现终止密码子。生物信息学...     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

小麦TaWRKY51基因的克隆、表达分析和转基因功能鉴定

WRKY是植物中特有的锌指型转录因子,其广泛参与植物对生物及非生物胁迫的响应过程.本研究从小麦(Triticum aestivum L.)中分离出一个新的WRKY转录因子基因TaWRKY51,其全长cDNA序列长度为1295 bp,其中开放阅读框(ORF)为942 bp,编码一个由313个氨基酸组成的多肽.用半定量RT-PCR进行表达谱分析,结果显示,TaWRKY51基因在分蘖节、叶和根系中的表达水平较高,并且受干旱胁迫诱导上调表达.在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过量表达TaWRKY51基因导致转基因株系侧根数目明显增多,并且对ABA、干旱和盐等胁迫处理的敏感性增加,表明该基因可能在植物响应非生物逆境胁迫信号传导过程中起负调控作用.本研究有助于揭示TaWRKY51基因调控植物侧根发育及响应非生物逆境胁迫的分子机制.     

茶树CsDREB-A2转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)类转录因子在植物逆境信号转导途径中具有重要的调控作用。为了解AP2/ERF转录因子在茶树逆境胁迫的分子调控机理,本研究从茶树龙井43叶片的cDNA中克隆得到一个编码CsDREB-A2转录因子的基因;对CsDREB-A2基因及其编码蛋白序列特征进行分析,并利用实时荧光定量PCR法检测该基因在茶树不同非生物胁迫处理下的表达水平。结果表明,CsDREB-A2基因开放阅读框为1 056 bp,编码351个氨基酸,其编码氨基酸序列具有AP2保守结构域,包含典型的YRG元件和WLG基序。AP2结构域第14、第19位氨基酸分别为缬氨酸和谷氨酸。拟南芥AP2/ERF家族转录因子的进化分析表明,该转录因子属于DREB亚族的A2组。CsDREB-A2相对分子质量为39 080 Da,理论等电点为5.32,属于亲水性蛋白,主要由α-螺旋和随机卷曲组成,无序化特征明显且存在一个LM无序区域;可能定位于细胞核,不存在信号肽和跨膜结构,属于非分泌蛋白。CsDREB-A2基因在高温(38℃)和干旱(200 g·L^-1 PEG)胁迫下均能快速诱导表达,并显著高于对照,分别在处理4、2 h达到最大值,为对照的20.70和42.90倍,植物在渗透胁迫下,可能通过ABA信号途径调节该基因对干旱的耐受性。高盐(200 mmol·L^-1 NaCl)胁迫下CsDREB-A2基因的表达受抑制,推测其可能存在负调控结构域降低该基因在盐胁迫下的表达量。本试验结果为研究DREB类转录因子在茶树抗逆胁迫的分子调控机制提供了一定的理论参考。     

棉铃虫线粒体cox2基因的克隆、序列及系统学分析

利用兼并性引物克隆出棉铃虫线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因(cox2),cox2基因编码框包含682个核苷酸,编码227个氨基酸的蛋白质;起始密码子为ATG,终止密码子仅有一个T组成。利用GenBank数据库搜索了其他12种昆虫的线粒体cox2基因序列,通过同源性比较,发现棉铃虫的cox2与鳞翅目4种蚕的cox2同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到85%~88%和93.0%~94.7%。同时,根据cox2核苷酸和编码的氨基酸序列进行了13种昆虫的分子系统学分析的探讨,发现分子系统树与形态分类基本一致,但略有差异。     

番茄中一个LSm1蛋白同源基因LeLSm1的克隆及表达分析

从番茄品种超级大明星中克隆LSm1蛋白同源基因LeLSm1。LeLSm1基因全长cDNA共有1 038个核苷酸,包含一个387个核苷酸的编码区,以及318个核苷酸的5′非编码区和333个核苷酸的3′非编码区,编码一个含128个氨基酸的蛋白质,分子质量为14.5 ku,等电点为4.94。LeLSm1编码的氨基酸序列包含LSm1蛋白的保守功能域,与截形苜蓿、拟南芥和水稻等植物的类似LSm蛋白具有高度的同源性,在氨基酸水平上的一致性依次为82.8%、82.0%和72.1%。用PCR方法克隆了LeLSm1基因,其全长转录区共4 751 bp,其中包含5个外显子和4个内含子。Southern杂交结果显示,LeLSm1是单拷贝基因。半定量RT-PCR分析表明,LeLSm1在番茄五叶期和结果期的根、茎、叶以及花和果实中均有表达,且表达量无明显差异,是一个组成型表达基因。     

花生生长素抑制蛋白基因AhARP的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状。为了挖掘控制花生种子休眠的重要基因,以花育52号为试材,通过转录组测序获得生长素抑制蛋白基因的全长,该基因全长为918bp,开放阅读框为363bp,编码121个氨基酸,推导出的蛋白质分子量为13.44 k Da,理论等电点p I=9.64。序列比对表明,该序列与花生生长素抑制蛋白基因Ah ARP一致,确认该c DNA序列为编码花生生长素抑制蛋白基因的全长c DNA序列。荧光定量PCR结果表明,Ah ARP基因在种子休眠阶段表达量较高,种子休眠解除后表达量降低;乙烯利释放吸涨种子休眠过程中,Ah ARP基因受到明显诱导;说明Ah ARP基因可能与花生种子休眠有关。Ah ARP基因的序列、结构、性质以及功能的初步分析,为进一步研究该基因在花生种子休眠中的功能机制奠定了基础。     

十字花科植物C2H2型锌指蛋白新基因BcMF20同源序列克隆与进化分析

为获取C2H2型锌指蛋白基因在物种间的分类和进化关系,分析其在基因结构上的保守性,更好地研究该基因在植物花粉发育中的功能,根据白菜花粉发育相关基因BcMF20 DNA序列设计引物,运用PCR技术分别从十字花科芸薹属和萝卜属18种材料中克隆了C2H2型锌指蛋白基因BcMF20的同源序列。经序列比对分析,BcMF20同源基...     

诸葛菜OvCYP86MF基因的克隆及其特性分析

为进一步阐明细胞色素P450基因CYP86MF在诸葛菜发育中的分子机理,本文根据已知同源基因保守序列设计特异引物,利用RT-PCR和RACE技术从诸葛菜中获得一个细胞色素P450基因(OvCYP86MF)全长cDNA序列,该序列全长为1876bp,含有1605bp的完整开放阅读框,可编码534个氨基酸,分子量和等电点分别为61.4kDa和6.90,具有细胞色素P450蛋白的典型特征,即保守结构域FNAGPRLCIG;原核表达显示该基因的融合蛋白在体外可以诱导表达;DANSTAR和Clustal W软件分析表明该基因的全长cDNA序列及其编码氨基酸序列与十字花科物种拟南芥相似性很高,达到80%以上,亲缘关系最近;与CYP86C亚家族成员在氨基酸水平上的相似性均高于50%,因此推断该基因属于CYP86C这个亚家族。Northern杂交分析表明该基因在花蕾中特异表达。     

华东葡萄抗白粉病转录因子基因的克隆及亚细胞定位分析

以抗白粉病华东葡萄（Vitis pseudoreticulata W.T.Wang）株系白河-35-1为材料,在经葡萄白粉病病原菌（Uncinula necator（Schw.）Burr.）诱导后获得的EST序列的基础上,本研究通过RACE技术克隆了一个具有转录域的转录因子全长1324bpcDNA序列,其阅读框为1053bp,编码350个氨基酸,命名为VpRFL1（GenBank登录号：FJ356672）。应用PCR技术,进一步获得了转录因子VpRFL1基因的DNA序列,其序列全长1599bp,VpRFL1基因包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析表明,华东葡萄白河-35-1VpRFL1基因编码的氨基酸序列在N端含有核定位信号,C端含有C4C4型RING锌指结构域。VpRFL1/PBI221-GFP在洋葱（Alliumcepa）表皮细胞中的瞬时表达分析表明,该转录因子主要定位于细胞核内。VpRFL1的序列特征与定位分析结果初步表明该转录因子基因在核内起作用,并可能参与了抗逆反应的相关途径。     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

普通白菜PGIP基因BcPGIP分子特征研究

根据甘蓝型油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因PGIP3的全长序列设计引物,从普通白菜核隐性不育两用系‘Bajh97-01A/B'可育株中成功克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因BcPGIP,对其DNA和cDNA全长序列进行分析,结果表明,该基因包含2个外显子和1个内含子,最大开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,共有10个LRR(Leucine-rich repeat,高氨酸富集)重复序列。将BcPGIP与其他植物的49个PGIPs蛋白进行同源序列比对后,发现PGIP蛋白特征序列非常保守。由重建的进化树可知,该基因与十字花科芸薹属的甘蓝型油菜的同源性最高。通过实时荧光定量PCR分析发现,BcPGIP基因可能与花粉的发育相关。     

甘蓝花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因BoMF9的克隆与特征分析

根据白菜花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF9的全长序列设计引物，通过PCR直接扩增的方法从结球甘蓝（Brassica. oleracea var. capitata）和芥蓝（B. oleracea var. alboglabra）中克隆得到BcMF9的同源基因BoMF9（BoMF9c和BoMF9l）。生物信息学分析和系统树构建发现BoMF9c和BoMF9l具有花粉特异表达的多聚半乳糖醛酸酶基因的序列特征。不同组织的表达特征分析发现它们分别在结球甘蓝和芥蓝的花蕾中特异表达。推测BoMF9c和BoMF9l可能在花粉萌发和花粉管伸长中起作用。     

菜心BrcuFCA基因的克隆与表达分析

本文以菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis（L.）Makino var.utilis）为实验材料,比较了Trizol法、改进Trizol法及改良SDS法提取菜心总RNA的效果。结果表明改进Trizol法集中了操作简单、耗时短、所需试剂种类少,且完整性好,产量和纯度均高等多重优点,成为提取菜心总RNA首选方案。同时文章以甘蓝型油菜及其它物种的FCA保守区设计引物,将质量高的菜心总RNA反转录合成cDNA,通过RT-PCR从菜心的早、晚熟品种中均克隆得到与开花有关的基因片段,将之命名为BrcuFCA,片段长1001bp,GenBank登录号为EU700363,与甘蓝型油菜及拟南芥FCA氨基酸同源性分别达到了98%和82%。另一方面,本研究还利用半定量RT-PCR研究了BrcuFCA不同时空表达特性,并结合已发表的开花调控遗传途径中两个关键基因BrcuFLC和BrcuFRI时空表达特性研究结果,推测菜心主要的抽薹开花途径不是春化和FRI-依赖途径,而很可能是自主开花途径。本研究为菜心抽薹开花分子机理的研究提供理论依据。     

喷施蔗糖和葡萄糖对小白菜硫代葡萄糖苷含量的影响

以小白菜"上海青"为试验材料,研究了喷施蔗糖和葡萄糖对小白菜生长和硫代葡萄糖苷含量的影响。结果显示,蔗糖和葡萄糖喷施对小白菜地上部鲜重和干重均没有显著影响,喷施蔗糖均能够显著增加小白菜总脂肪族硫代葡萄糖苷、总吲哚族硫代葡萄糖苷和总硫代葡萄糖苷含量,其中,0.1mol/L蔗糖喷施显著提高了3-丁烯基硫代葡萄糖苷和吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷含量,0.2mol/L蔗糖喷施显著增加了吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷和4-甲氧基吲哚-3-甲基硫代葡萄糖苷含量。0.2mol/L葡萄糖喷施显著增加总硫代葡萄糖苷及单个硫代葡萄糖苷含量。蔗糖和葡萄糖喷施均有增加总吲哚族硫代葡萄糖苷相对百分含量的趋势。研究表明外源喷施糖对小白菜硫代葡萄糖苷含量和组成具有显著的影响。     

铵硝比例对不同基因型小白菜硝酸盐积累影响机理研究

本研究以前期工作中筛选出的硝酸盐积累量存在显著差异的2个不同基因型小白菜品种为材料,在人工气候箱水培条件下研究了不同铵硝比例对小白菜硝酸盐积累量、硝酸还原酶活性（NRA）和硝酸盐吸收基因NRT1和NRT2的表达量的影响。结果表明,不同铵硝比例对小白菜硝酸盐积累量有显著影响,且存在基因型差异。四月慢对硝酸盐吸收、积累及同化利用的能力都强于华冠青梗菜,尤其是在高NO3- 比例处理时。与华冠青梗菜相比,四月慢对NO3- 的同化利用的能力更不易受铵硝比例的影响。NRT1和NRT2主要在根部表达,且NRT1的表达量显著高于NRT2,NRT1和NRT2的表达量变化规律只能在一定程度上解释小白菜不同基因型间硝酸盐积累量的差异,小白菜不同基因型品种间硝酸盐积累量差异的机理还需要进一步研究。     

滨海盐碱地隔盐改良对两种草本地被的光合特性影响

在上海崇明岛瀛东村研究碎石铺设盐碱土改良措施对土壤EC值的影响,以及土壤盐分变化对紫鸭趾草（Setcreasea purpurea B.K.Boom）和中华常春藤（Hedera nepalensis var.sinensis）两种植物光合特性的影响。结果表明：实施土壤改良措施后,不同处理间EC值差异逐渐显著。土壤EC值的变化对紫鸭趾草的净光合速率和蒸腾速率影响不大,而对中华常春藤影响显著。在光响应曲线和参数比较中,采用非直角双曲线模型模拟,光响应曲线的变化趋势基本一致;在同等光合有效辐射（PFD）时Pn值表现为4cm铺设厚度〉2cm铺设厚度〉0cm铺设厚度。随着土壤盐分浓度降低,紫鸭趾草和中华常春藤的最大净光合速率（Ama）x、表观量子效率（AQY）、光饱和点（LSP）和光补偿点（LCP）均逐渐升高。紫鸭趾草的光合作用对土壤盐分具有较强的适应性,并对强光保持了很强的利用能力,但对弱光的调节作用不显著,而中华常春藤适应性较弱,对强光的利用能力较低,但对弱光利用能力强。总之,两种植物的光合适应性均受到土壤盐分的影响,紫鸭趾草比中华常春藤适应性更强。在盐碱地植物应用中从光合特性考虑,紫鸭趾草更适应当地土壤,但通过碎石铺设盐碱土改良技术,降低土壤盐分浓度后,亦可提高植物对光环境的适应性。     

苹果基因邻近未知序列的PCR扩增与测序方法

本文提出的方法是首先利用已知基因序列设计三个巢式PCR引物p14、p15和p16,然后设计3’端为常见酶切位点、5’端为随机引物序列p17的9个酶切位点引物,用p14外引物与9个酶切位点引物进行第一轮PCR扩增,其中前5个反应的退火温度较低可以将酶切位点引物的5’端序列引入到PCR产物中,其余反应则以此PCR产物为模板采用较高的正常退火温度进行,退火温度较高是为了使整个酶切位点引物能稳定地结合到最初反应形成的产物上。为提高PCR产物的特异性和产量,用p15和p16引物分别与p17引物配对进行第二轮和第三轮PCR扩增,电泳检查发现PCR产物条带后进行纯化和测序。为保证序列的正确性,利用测得的DNA序列再设计新引物f3x与p14(或p15)配对,直接用提取的DNA为模板进行PCR扩增和测序。利用此方法成功地获得了苹果FPPS基因邻近的启动子序列528bp和5’UTR序列142bp,并已在GenBank注册（登录号FJ263960）。利用Blastn发现这是GenBank中首次发表苹果FPPS基因启动子序列。这说明用该方法获取基因邻近的未知序列是可行的。