烟草雄蕊特异表达启动子TA29的克隆及序列分析

采用SDS法提取烟草(Nicotiana tabacum)叶片总DNA,根据GenBank中相关序列设计并合成1对特异引物,通过PCR扩增获得一特异片段,并将其连接到pMD8-T载体上进行克隆测序.结果表明:该片段全长543 bp,与GenBank中报道的序列(AX012339)存在1个碱基的差异,同源性达99.8％;同时,采用生物软件对其进行序列分析,发现该片段含有启动子必备的核心元件:1个TATA-box、8个启动序列元件[PyPyAN (T/A) PyPy]以及1个CAAT-box、1个Cap site、1个I-box等元件,还存在与花粉特异性调控相关的AGAAA和GTGA等2个元件,推测该序列功能与雄蕊特异表达启动子TA29功能相同,从而为后期植物表达载体的构建及转基因奠定了基础.     

水稻种子特异表达基因OsEnS38的克隆与表达

以粳稻中花11为材料,利用生物信息学技术,结合RT–PCR,克隆了水稻OsEnS38的c DNA序列;其编码的蛋白序列包含2个Cupin_1保守结构域,属于典型的Bicupin亚家族。启动子分析发现,OsEnS38启动子区域含有多种与胚乳特异表达相关的顺式作用元件;q RT–PCR和原位杂交结果证实,OsEnS38在开花后7~14 d的种子中特异表达,在第10天的胚乳中表达量最高,达29.73;杂交信号在第7、10天的胚乳中高表达;共表达分析显示,共表达基因参与水稻胚后发育和生殖发育调控,表明该基因在种子发育和储藏物质积累过程中发挥作用。     

花药特异表达基因TaRAFTIN1a启动子的克隆及表达载体构建

组织特异性启动子是植物基因工程改良的重要工具。RAFTIN是禾本科植物花药绒毡层中特异积累与花药发育相关的蛋白,其调控序列可能提供一个很好来源的花药特异性表达启动子。为了解小麦TaRAFTIN1a基因启动子的花药表达特异性,本研究分离了TaRAFTIN1a基因的启动子,生物信息学分析表明,该启动子含有3种花药特异表达元件(总计10个),1个ABRE脱落酸响应元件,TGACG-motif与CGTCA-motif茉莉酸甲酯响应元件各1个,8个ARR1AT细胞分裂素响应元件,以及2个DRE和1个MBS干旱响应元件。采用5'端缺失的方法,分别克隆1429、898和351 bp的启动子片段,经连接、转化与鉴定,构建了3个含TaRAFTIN1a启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,p WAER1,p WAER2,p WAER3,为通过转基因了解启动子的表达特征及其核心作用元件奠定了基础。     

矮牵牛果实特异表达启动子FBP7的基因克隆及序列分析

为进一步实现外源基因在草莓果实中的特异表达,克隆了矮牵牛果实特异表达启动子FBP7。根据GenBank发表序列设计引物,以矮牵牛(Petunia hybrida)总DNA为模板,通过PCR扩增获得约500 bp的DNA片段,回收该片段并克隆至PUC18载体上,测序后将所得序列与原序列进行比对,其同源性为97%。为分析这些差异序列是否影响启动子功能,进行了启动子功能预测及顺式作用元件分析。结果表明,所克隆的启动子序列应具有启动子功能,且能实现果实特异表达,其序列分析差异可能是由于个体差异及多态性的影响,为草莓果实特异表达启动子的选择提供新思路。     

牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析

根据G enB ank中已公布的人、猪和小鼠的MyoG基因的5′侧翼和部分第一外显子序列设计PCR引物,用touch-dow n PCR技术扩增了牛MyoG基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGEM-T-MyoG,并通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定、测序及生物信息学分析。结果表明,牛MyoG基因的启动子序列(G en-bank中注册号为AY 882581)长度为672 bp,其与猪、人和小鼠相应序列的同源性分别为94%,91%和88%,且其在不同物种之间具有一定的保守性。牛MyoG基因启动子的克隆与序列分析为进一步研究牛MyoG基因的表达调控奠定了基础。     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

葡萄LEAFY基因启动子的克隆与序列分析

为探明葡萄LEAFY基因的表达调控规律,应用PCR技术从藤稔葡萄中克隆了1个长1 833 bp的DNA片段,该序列含有2个内含子区域,编码402个氨基酸,与葡萄LEAFY同源基因VFL有99%的同源性.应用基因组步移法克隆了LEAFY基因的5′侧翼序列925 bp,拼接后的LEAFY基因及启动子序列共2 692 bp(GenBank登录号EF222286).用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控.用FootPrinter在线工具对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性.     

百合花特异启动子PchsA表达载体的构建及功能分析

【目的】分析从百合中克隆获得的查耳酮合成酶基因(chsA)启动子的组织表达特性。【方法】将chsA启动子片段插入到双元表达载体pCAMBIA 1381中,成功构建了植物表达载体pCAMBIA-CHS,通过根癌农杆菌EHA 105转化拟南芥,用50 mg/L潮霉素对转化植株进行筛选,对阳性植株进行PCR检测和GUS组织化学分析。【结果】PCR检测表明,chsA启动子片段已经整合到拟南芥基因组中,GUS组织化学分析显示,在拟南芥花序中有很强的GUS活性,叶腋处有微量表达,其他组织中不表达。【结论】初步证明百合chsA启动子为花特异表达启动子。     

矮牵牛花特异表达启动子PchsA的克隆及蓝色基因F3′5′H表达载体的构建

[目的]克隆花特异表达启动子PchsA,将此启动子与蓝色基因“F3′5′H”构建新的表达载体,拟以该启动子驱动“F3′5′H”在其他花色中特异表达。[方法]根据GenBank报道的矮牵牛启动子的序列设计并合成一对特异引物,以蓝紫色矮牵牛总DNA为模板,用PCR仪扩增目的片段。[结果]PCR扩增出的启动子DNA片段长约550bp,回收后连接到PGM-T质粒载体上,经转化、筛选确定重组子,酶切鉴定后送上海生工生物工程公司测序,得到片段长度为553bp。经DNAMAN软件分析和GenBank上BLAST序列比对,显示序列与已报道序列同源性为98．55％。应用pcgene软件进行序列分析,结果表明试验克隆的启动子含有启动子所必须的所有调控元件,这与报道的序列基本一致。[结论]试验成功地克隆了CHSA启动子并将其与“F3′5′H”构建成能够在植物中进行道传转化的表达载体,为培育新型花色新品种奠定了基础。     

水稻花药特异表达基因RA8的启劝子的分离和结构分析

根据文献设计一对引物，通过PCR的方法扩增了RA8是水稻花药特异表达基因的启动子。序列分析表明该启动了含有CAAT box的序列CAAT、TATA box的序列TATAATA等表达调控元件，以及编码区的起始密码子ATG。     

矮牵牛花色遗传研究进展

经过对植物花色在生物化学和遗传学2个方面近1个世纪的研究以及遗传学的不断发展,证实矮牵牛也许可以为花色分析提供最好的遗传体系,连同基因工程学的应用,可以对许多影响花色改变的基因进行分离和分子特性分析。该研究主要讨论了影响矮牵牛花色的因素、矮牵牛花色的遗传调控、矮牵牛花色的改良方法以及应用前景。     

矮牵牛花色CHS-A基因启动子(Pchsa)的克隆及序列分析

根据国外报道,矮牵牛花色相关基因CHS-A的启动子Pchsa具有花期特异性启动子的活性,人工合成2个特异性引物并从矮牵牛基因组中经PCR分离出长约500 bp的DNA片段,经纯化后测序得到499 bp的目的片段。在NCBI中通过BLAST程序与序列号为S52984的PchsA比较,其同源性为95.73%。应用DNAMAN软件进行序列分析,结果表明该片段除含有启动子的保守序列TATA-box、CAAT-box、GC-box、G-box外,还含有花期特异表达的启动序列TACPyAT-box。这为该序列在花卉改良中的进一步运用奠定了基础,同时也证明不同品种间的PchsA存在差异。     

农杆菌介导的矮牵牛遗传转化美洲商陆抗病毒蛋白基因的研究

为获取矮牵牛抗病毒株系,利用农杆菌介导的叶盘法,对3个品种的矮牵牛进行了PAP(美洲商陆抗病毒蛋白)基因遗传转化试验。结果表明,矮牵牛基因型对抗性芽的再生有显著影响,只有红色波浪系矮牵牛在含100 mg/L的卡那霉素筛选培养基上获得抗性芽,进一步转入含卡那霉素100 mg/L的生根培养基上进行筛选,获得31个株系的生根植株。对再生植株进行PCR检测,初步证明PAP基因已整合到其中29个株系的矮牵牛基因组中。     

F3′5′H基因的克隆、表达载体构建与矮牵牛遗传转化

类黄酮3′5′羟基化酶(Flavonoid-3’,5-’hydroxylase;F3′5′H)是花色素苷代谢途径中的一个关键性酶,能使花色素的合成趋向于形成蓝色的飞燕草色素。从蓝紫色矮牵牛的花瓣中提取总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到了约1.7kb的F3′5′H片段。F3′5′H的cDNA序列分析结果表明,克隆得到的序列与原序列同源性达到99.34%,开放读码框为1 521 bp,编码507个氨基酸。将推算的氨基酸序列与NCBI登录的氨基酸序列进行分析比较,发现与文献报道的存在2个氨基酸差异,氨基酸同源率为99.6%。将此基因构建到含有35S启动子的植物表达载体PBI-F3′5′H上,并通过农杆菌介导法对粉红色矮牵牛进行了遗传转化,初步鉴定获得了转基因植株。     

40个国外矮牵牛F_1代主要性状分析

运用数学方法对40个国外矮牵牛F1代4个主要性状进行方差分析和相关性分析。结果表明,超越红、贵族粉红、夏威夷粉红、夏威夷蓝、贵族白、夏威夷白、超越玫瑰红、夏威夷亮玫瑰红、贵族酒红脉为比较理想的品种;矮牵牛各主要性状中株幅和株高相关性极显著,株幅和花径相关性极显著,花径和株高相关性显著。     

矮牵牛的快速繁殖

矮牵牛带芽嫩茎、嫩叶作为外植体,经培养都能再生完整植株。诱导分化阶段,带芽嫩茎以腋芽发育为主,也有不定芽发育,最适培养基MS＋6-BA0．5mg／L＋NAA0．1mg／L或MS＋6-BA1．0mg／L＋NAA0．5mg／L;叶片以不定芽发育为主,在MS＋6-BA0．5mg／L＋NAA0．5mg／L及MS＋6-BA1．0mg／L＋NAA0．1mg／L培养基上,丛生芽分化效果最好。继代增殖阶段,切割新梢接种于MS培养基或切割丛生芽接种于MS＋6-BA0．5mg／L培养基,均可获得6～10倍的增殖。生根培养阶段,1／2MS＋IBA0．01—0．05mg／L培养基的生根效果好,移栽成活率可达95．6％。     

矮牵牛愈伤组织耐盐性研究

[目的]了解矮牵牛愈伤组织的耐盐能力。[方法]将矮牵牛嫩叶接种到8种不同盐浓度的MS培养基中培养,观察愈伤组织生长分化情况。[结果]当培养基盐度为0.4%时,矮牵牛愈伤组织诱导率与对照无差异;当培养基盐度为0.8%以下时,提高盐度能促进矮牵牛愈伤组织的芽分化率;当培养基盐度大于0.8%时,矮牵牛愈伤组织的生长分化受到抑制;当培养基盐度达到2.8%时,矮牵牛外植体全部死亡。[结论]矮牵牛愈伤组织可适应0.8%以下的盐度。     

矮牵牛叶肉原生质体分离条件的优化

以幼嫩叶片为试材,探讨了渗透压(甘露醇浓度)、水解酶浓度、酶解时间等关键因素对矮牵牛叶肉原生质体分离效果的影响。研究结果表明,以2%纤维素酶R-10+0.2%果胶酶Y-23+0.4%离析酶R-10+20 mmol/L 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)+0.1%牛血清白蛋白(BSA)+0.11%无水氯化钙(CaCl_2)为酶解液,在0.5mol/L甘露醇浓度下静置酶解5h,1 100r/min离心2min沉淀原生质体,原生质体产量及活性分别为2.90×106个/g和88.1%,可为后续原生质体培养及融合提供材料。     

利用ISSR对矮牵牛品种遗传多样性的聚类分析

为了揭示矮牵牛品种资源的遗传多样性,并更好地应用于育种工作,利用ISSR分子标记技术对142份矮牵牛材料进行了遗传多样性研究。在供试材料中,筛选到具有多态性的ISSR引物17个,共扩增出多态性条带132条,平均每个引物扩增的多态性条带数为7.8条,多态性条带比率为82.5%。材料间遗传相似系数范围在0.401 5～0.931 8间,这说明矮牵牛具有丰富的遗传多样性。通过软件计算结果表明,142个矮牵牛品种平均有效等位基因数为1.653 5±0.285 3,Nei基因多样性指数平均为0.374 4±0.123 6,平均Shannon信息多样性指数为0.552 6±0.148 6。将矮牵牛材料聚类结果与其花色、花型、植株类型、品种来源作比较,呈现一定的相关性,这为矮牵牛优良品种的选育奠定了一定的理论基础。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。