高粱抗丝黑穗病基因SRAP体系优化

为建立高粱抗丝黑穗病基因最佳的SRAP-PCR反应体系,进一步筛选与抗病基因相关的SRAP标记。本研究采用单因素与正交设计相结合的方法,对影响高粱SRAP-PCR体系的5个因素Taq酶、Mg2+、模板DNA、d NTPs和引物进行优化,以期筛选出最优的高粱抗丝黑穗病基因SRAP-PCR反应体系。研究表明:在优化得到的20μL的高粱SRAP-PCR体系中,模板DNA的用量为20.0 ng,Taq DNA聚合酶的用量为0.14 U,Mg2+的浓度为3.0 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物的浓度为0.5μmol/L。各因素对反应体系影响大小依次为:引物浓度DNA用量Taq DNA聚合酶浓度Mg2+浓度=d NTPs浓度。本研究将为高粱抗性基因的定位与功能研究提供基础数据与技术支持。     

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

油松cDNA SRAP-PCR反应体系的建立与优化

为了建立油松cDNA SRAP-PCR反应体系,利用正交设计L16(45)对PCR反应体系的Taq酶、模板cDNA、引物、Mg~(2+)、d NTP这五个因素在四个水平上进行优化。使用SPSS软件对PCR结果结合方差分析和直观分析。结果表明:不同因素水平的变化对SRAP-PCR反应的影响大小依次为d NTP模板c DNATaq酶引物Mg~(2+)。筛选各因素最佳水平,油松c DNA SRAP-PCR最佳反应体系(20μL):Taq酶2 U,c DNA模板用量80~120 ng,引物浓度0.4μmol/L,Mg2+浓度1.5 mmol/L,d NTP浓度0.2 mmol/L。这一优化体系的建立有助于今后利用cDNA-SRAP技术对油松进行基因表达差异的分析。     

郁金香ISSR-PCR体系建立与优化

本研究以22个郁金香品种为材料,采用正交设计试验和单因素试验对ISSR-PCR反应中的5个影响因素:Mg~(2+)、d NTPs、Taq酶、引物、模板DNA进行4个水平的优化试验。结果表明最佳反应体系为:25μL体系中Mg~(2+)1.0 mmol/L、d NTPs 0.15 mmol/L、Taq酶0.25U、引物0.2μmol/L、模板DNA 100 ng。退火温度为58℃。该体系的建立有利于ISSR分子标记技术研究郁金香种质资源遗传多样性。     

濒危植物香果树(Emmenopterys henryi)SRAP反应体系的建立与引物筛选

以珍稀濒危植物香果树(Emmenopterys henryi)基因组DNA为研究对象,对影响SRAP-PCR反应的因素如Mg~(2+)浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶、引物浓度4因素进行优化。确定香果树SRAP反应体系为:20μL PCR反应体系,50 ng模板DNA,1×Buffer,2.5 mmol/L Mg~(2+),1 U Taq聚合酶,0.3 mmol/L d NTPs,正向和反向引物各0.3μmol/L;在香果树2份样品中进行引物初筛,利用已发表的SRAP引物,选取8条正向引物和8条反向引物,共计64对引物。从中筛选出10对重复性好,谱带清晰且稳定的引物。并将这些引物在香果树2个野生居群20份样品中进行遗传多样性分析,共得到72条扩增谱带,其中多态性谱带60条,多态性比率83.3%,平均每个引物组合产生6个多态性位点,供试材料间遗传变异相对丰富。     

宫粉紫荆SRAP-PCR反应体系的建立及优化

为建立最佳的宫粉紫荆SRAP-PCR反应体系,采用单因素和L16(45)正交试验设计对反应体系中的模板DNA、Mg2+、引物浓度、d NTPs和Taq聚合酶进行优化。表明宫粉紫荆SRAP-PCR 25μL反应体系的最佳组合为:模板DNA 50 ng、Mg2+2.25 mmol/L、引物0.25μmol/L、d NTPs 0.30 mmol/L、Taq酶1.5 U。并利用优化的SRAP-PCR体系进行验证,表明不同的宫粉紫荆样本均能扩增出清晰且带型基本一致的谱带,表明本试验建立的SRAP-PCR体系稳定,可用于今后开展宫粉紫荆种质资源遗传多样性研究、品种鉴定、优良品种筛选和近缘种杂交育种等研究工作。     

丝瓜SRAP反应体系的优化

以丝瓜基因组DNA为模板,对SRAP反应中主要五个影响因素d NTP浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度进行优化,建立丝瓜SRAP-PCR反应的体系。根据实验确定的最佳反应体系为25μL SRAP体系。25μL SRAP体系为:75 ng DNA,0.2 mmol/L d NTP,1.25 U Taq酶,0.16μmol/L的单条引物,2.0 mmol/L Mg~(2+),2.5μL 10×Buffer。选用33个丝瓜品种对所确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、亮度高、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于丝瓜的SRAP分子标记。     

花吊丝竹ISSR-PCR反应体系的正交优化

本研究利用L16(45)正交试验设计,对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因素(Mg~(2+)浓度,d NTPs浓度,Taq DNA聚合酶浓度,引物浓度及模板DNA含量)进行优化。并在50~60℃范围内摸索引物UBC845的最适退火温度,并建立了花吊丝竹的最佳ISSR-PCR反应体系:2.5 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,0.5μmol/L引物,80 ng模板DNA,2μL 10x Buffer,9.5μL dd H2O,ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s;52.7℃退火30 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。利用优化的反应体系从100条引物中筛选出16条多态性较好的引物,该体系的建立有助于花吊丝竹种质资源遗传多样性分析和指纹图谱的构建。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

红毛丹SRAP反应体系优化及多态性标记筛选

为建立成熟可靠的红毛丹SRAP-PCR扩增检测技术体系,本研究首先采用单因素实验设计,对反应体系中的DNA模板、Mg2+、d NTPs、Taq DNA聚合酶和引物浓度等5个主要影响因素,设置不同的水平梯度,筛选出适宜的因子范围;在此基础上,进一步采用L16(45)正交设计,建立了红毛丹SRAP-PCR最佳反应体系:20μL体系中包含DNA模板20 ng、d NTPs 0.25 mmol/L、引物0.6μmol/L、r Taq酶1.0 U、Mg2+2.5 mmol/L。并利用优化的反应体系,从116对SRAP引物组合中筛选出37对扩增条带清晰、产物多态性较好的引物。本研究建立的SRAP-PCR体系及筛选的引物,将为红毛丹从分子水平进行种质资源遗传多样性分析、品种指纹图谱构建等研究提供基础。     

苹果砧木SRAP-PCR反应体系的优化及耐盐性标记的筛选

本研究以苹果砧木SH38为材料,利用正交试验设计对影响SRAP-PCR反应的4因素(Taq DNA聚合酶、模板DNA,d NTPs,引物)4水平进行优化,并构建苹果砧木SH38的SRAP-PCR的最佳反应体系。结果显示:15μL的总反应体系中,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为0.75 U,上、下游引物为50 ng,DNA模板用量为60 ng。运用该反应体系并结合BSA法,从128对引物组合中筛选出4对引物,该4对引物扩增出的特异性片段与苹果砧木的耐盐基因存在连锁。研究结果可为苹果砧木利用SRAP分子标记进行耐盐性的分子标记辅助育种提供基础。     

山丹百合cpDNA-PCR反应体系建立与优化

本试验以采自青海东南部地区的山丹百合为材料,结合单因素与L_(16)(4~5)正交设计对山丹百合cpDNA-PCR反应体系的Mg~(2+)、d NTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度进行优化,建立最优的山丹百合cpDNA-PCR反应体系,为研究山丹百合遗传多样性及其演变提供技术支持。研究表明:在25μL反应体系中,以Mg~(2+)2.0 mmol/L、d NTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Taq酶0.25 U、模板DNA 50 ng最佳,退火温度优化后为53.1℃。建立的反应体系在6个山丹百合居群中经验证具有较高的稳定性和重复性,可用于山丹百合遗传多样性和分子谱系地理学方面的研究。     

杜鹃花SCoT-PCR反应体系的优化及引物筛选

本试验以马银花(R.ovatum)DNA为模板,采用L16(45)正交试验对目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)体系中5因素(Taq聚合酶用量,Mg~(2+)浓度,模板DNA用量,dNTPs浓度,引物浓度)进行了优化,建立了杜鹃花植物SCoT-PCR反应体系。结果表明,在20μL的反应体系中,模板DNA 1.00 ng/μL,Mg~(2+)为3.00 mmol/L,dNTPs为0.25 mmol/L,引物为0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶为2.00 U。比较了各因素对反应体系的影响,发现引物物浓度的差异对体系影响显著,各因素影响的先后顺序为引物Taq DNA聚合酶dNTPsMg~(2+)模板DNA。并运用了杜鹃属的4个不同种对最优体系进行了稳定性验证,选择了10个通用性的引物进行筛选,发现10个引物均能扩增出条带,其中有6个引物能够得到清晰可辨、多态性丰富的条带。该体系的建立将为杜鹃花遗传多样性、差异基因的表达分析,分子辅助育种、遗传图谱构建等研究提供技术支持。     

新疆枣种质资源SRAP-PCR反应体系的建立及优化

以枣树嫩叶为材料,采用单因子试验对影响SRAP-PCR反应体系中的各个因素进行优化,建立可靠、稳定的SRAP-PCR体系,为进一步研究新疆枣种质资源遗传多样性、亲缘关系、指纹图谱的构建等提供帮助。结果表明,最佳SRAP-PCR反应体系为:总体积25.0μL,其中模板DNA用量为30 ng,Mg2+浓度为2.5 mmol/L,引物浓度为0.2μmol/L,d NTPs浓度为0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U,该体系经验证,能扩增出清晰、稳定、多态性较好的产物,说明经过优化后的PCR体系较好,适合后续的分析研究。     

郁金香SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。     

短芒披碱草SRAP-PCR 体系的建立和优化

通过单因子和正交设计两种试验方法,对短芒披碱草SRAP-PCR体系进行优化,得到短芒披碱草20μL SRAP-PCR最优反应体系为：Mg2＋2.00 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、d NTPs250μmol/L、DNA 30 ng和10×buffer 2μL;各因素水平变化对PCR反应影响从大到小依次是：Mg2＋、引物、Taq酶、d NTPs和模板DNA。运用该优化体系对6份短芒披碱草材料进行验证,电泳结果显示扩增条带多态性高,清晰无杂带。该优化体系的建立有助于将SRAP标记技术用于短芒披碱草的遗传育种等研究。     

催吐萝芙木SRAP反应体系的优化及引物筛选

本研究以催吐萝芙木为材料,利用正交试验设计对影响SRAP-PCR反应的不同浓度模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物和d NTP进行优化,建立催吐萝芙木的SRAP-PCR最佳反应体系。20μL反应体系包括:10×Taq Plus Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)2μL,d NTP 0.2 mmo1/L,Taq DNA聚合酶0.75 U,模板DNA 40 ng、正/反引物各1.2μmo1/L。在此条件下,对能够在催吐萝芙木、四叶萝芙、蛇根木、苏门答腊萝芙木、云南萝芙木中扩增的引物进行了筛选,获得30对具有通用性扩增的引物,为后续通过SRAP探讨其遗传多样性和亲缘关系方面的研究提供参考。     

葡萄5BB品种SRAP-PCR反应体系影响因素

为建立适合葡萄5BB品种的SRAP-PCR反应体系,利用正交设计对葡萄SRAP-PCR反应体系5种因素(Taq DNA聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)4个水平进行优化。结果表明,各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小顺序为:Mg2+,引物,dNTP,Taq DNA聚合酶,模板DNA;筛选出各因素的最佳水平,建立了葡萄5BB品种SRAP-PCR反应的最佳体系(20μL)为:Taq DNA聚合酶2U,Mg2+2.0mmol/L,模板DNA60ng,dNTP0.25mmol/L,引物0.10μmol/L。这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对葡萄进行相关研究提供了帮助。     

万寿菊雄性不育系SRAP-PCR体系建立与优化

本研究以万寿菊雄性不育系2-2基因组DNA为试验材料,采用单因素和L16(45)正交设计对SRAPPCR反应体系的Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物和模板DNA浓度进行优化,以得到最佳的SRAP-PCR反应体系。结果表明最佳反应体系为:20μL体系中Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 0.3 mmol/L、Taq酶0.75 U、引物0.2μmol/L、模板DNA 80 ng。应用建立的反应体系对退火温度进行优化,得到两步退火温度分别为35℃和50.2℃。最后用9个万寿菊雄性不育两用系材料组对所得PCR体系进行验证,证明该体系具有较高的稳定性和重复性,可为筛选与万寿菊雄性不育基因连锁的特异性标记奠定基础。     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L_(16)(4~5)正交试验设计。通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg~(2+)、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、Mg~(2+)和模板DNA浓度分别为1 U/20μL、0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.25 mmol/L和75 ng/20μL。扩增实验结果表明,该反应体系稳定性较好,可重复性高,具有较好的分辨率。可从59对引物中筛选出14对适用于元宝枫并具有较明显的多态性的SSR引物,为进一步研究元宝枫的分子标记辅助育种、SSR遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了良好的基础。