基于转录组测序的槜李EST-SSR标记开发

为开发槜李EST-SSR标记,本研究利用MISA软件筛选了槜李花转录组测序获得的35584条Unigenes,对其SSR信息进行分析后,利用Primer Premier 3.0软件设计EST-SSR引物,并随机选取40对SSR引物对12个李品种进行EST-SSR引物筛选及多态性分析。结果发现,在槜李花转录组中共搜索到个10791个SSR位点,分布于8433条Unigenes,SSR发生频率为23.70%,平均每3.71 kb含有1个SSR;SSR重复基元中二核苷酸重复出现频率最高,占总SSR数量的52.98%,其次为三核苷酸重复(占24.00%)和单核苷酸重复(占20.95%);二核苷酸重复基元以AG/CT为主(85.95%),三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主(31.24%)。利用Primer Premier 3.0软件共设计出9870对候选引物,随机选择40对引物对12个李品种进行SSR引物筛选及多态性分析。40对引物均能扩增出预期大小的条带,有效扩增效率为100%,40对引物中有5对引物在12个李品种中表现出多态性。本研究开发的EST-SSR标记可为李属植物遗传多样性分析提供丰富的候选标记,同时可为槜李发育相关功能基因定位、遗传图谱构建、及分子标记辅助育种等研究提供帮助。     

濒危珍稀植物半枫荷转录组中SSR位点分析

分析半枫荷转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为半枫荷EST-SSR分子标记提供有力工具。利用MISA工具筛选了半枫荷转录组测序获得的77629条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;在此基础上利用Primer 3.0设计SSR引物,并随机选择50对SSR引物对4株不同来源的半枫荷进行多态性扩增分析。在半枫荷的转录组中,共找到15041个SSRs,分布于10669条Unigenes,SSR位点发生频率为13.74%,含多个位点的序列数为3114,占SSRs位点总数的29.19%,以复合形式出现的位点数2044个,占SSRs位点总数的19.16%,SSRs的平均距离是3.2 kb。SSRs位点中二碱基重复是主要类型,占总SSRs的42.17%;其次是单碱基重复基序(38.25%)SSRs。所包含的重复基元中,单碱基重复基元A/T(5572),二碱基重复基元AG/CT(4845)是优势重复基元类型,分别占总SSRs的37.05%、32.21%。利用Primer 3共设计出28590对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中44对(88.0%)扩增出清晰、可重复的条带,15对(34.1%)扩增条带表现出多态性。半枫荷转录组SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析、分子标记辅助育种和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

基于灯盏花全基因组SSR位点分析及多态性引物开发

本研究利用MISA工具筛选灯盏花基因组测序获得的462 622条scaffolds,对其SSR位点信息进行分析,Primer 3设计SSR引物,随机选取200对引物对60株灯盏花进行多态性扩增分析。研究结果表明:从灯盏花基因组中搜索到的231 852个SSR位点中,二核苷酸基序是主要的重复类型,占总SSR的47.14%;AT/AT是最多的二核苷酸重复基元,占二核苷酸重复基元的74.60%,AAT/ATT是出现最多的三核苷酸重复基元,占三核苷酸重复基元的15%。PCR扩增发现,200对引物中有30对(15%)表现出稳定的多态性差异。灯盏花基因组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为灯盏花的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记,利于开展灯盏花的遗传育种研究。     

星油藤转录组SSR序列特征分析及其分子标记开发

基于星油藤(Plukenetia volubilis L.)转录组信息,分析其表达序列标签-简单序列重复(expressed sequence tag-simple sequence repeat, EST-SSR)并设计引物进行验证,为星油藤的SSR分子标记开发提供数据支持。本研究利用MISA软件对星油藤雌雄花序芽转录组测序所获得的57 664条Unigenes进行分析,共检测出10 572个SSR位点;其中8 825条Unigenes分布有SSR位点,占总Unigenes的15.30%。SSR位点的平均分布频率为每5.34 kb出现1个SSR位点。各类型的SSR位点共有154种,其中单核苷酸重复(40.48%)、二核苷酸重复(25.82%)和三核苷酸重复(28.89%)为主要的重复类型,A/T、AG/TC和AAG/CTT分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸类型中主导的重复基序。利用Primer 3.0设计EST-SSR引物,并随机挑选75对SSR引物,以星油藤及其2个近缘种(亚洲星油藤和大果星油藤)为材料进行筛选验证,其中31对引物可进行有效扩增,并最终获得7对在3个物种间具有多态性的引物。本研究结果表明,星油藤转录组测序产生的Unigenes序列信息作为开发SSR分子标记是可行的,开发的这些SSR分子标记可用于星油藤及其近缘种的遗传多样性评价、种质资源鉴定和分子标记辅助育种等研究。     

基于油楠(Sindora glabra)转录组测序的SSR分子标记的开发

油楠(Sindora glabra)作为极具开发潜力的能源植物,在分子水平上的研究仅局限于ISSR分子标记。本研究利用Trinity软件对油楠转录组数据进行组装,共得到总长为48307806 bp的283998条Unigenes。利用MISA软件寻找到97443个含有SSR的重复基元。SSR位点中主要重复序列为单核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR位点的67.68%和22.56%,其次是三核苷酸,占8.54%。利用Primer 3.0设计引物,并从中随机选择200对引物进行PCR扩增,其中有13对扩增出清晰条带,多态性高,重复性好。油楠SSR分子标记的开发对于研究其遗传多样性、重要性状基因定位及分子标记辅助选择育种等起到重要的推动作用。     

基于RNA-seq牡丹SSR标记开发及通用性分析

从牡丹花色候选基因中开发一套SSR标记,为牡丹花色分子遗传学研究和分子标记辅助育种提供帮助。本研究基于高通量转录组测序技术(RNA-seq)获得了278条涉及调控牡丹花色形成的Unigenes序列,利用SSRIT在128条Unigenes中检测到215个SSR位点,出现频率为46.04%。其中优势重复基序为二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复,分别占总SSR位点的18.60%、41.86%和36.28%,优势重复基元为TC/GA和AT/TA,分别占二核苷酸重复的30.00%和27.50%。在此基础上,从中选择100对SSR引物合成,以牡丹品种基因组DNA为模板,验证其有效性和多态性。结果表明,有效引物50对(占50%),多态性引物12对(占24%)。12对多态性引物在芍药属12个不同种质内进行通用性检测,转移率范围为83.33%~100%,平均转移率为96.53%,表明牡丹SSR标记在芍药属内具有较高的通用性。利用高通量RNA-seq开发牡丹候选基因SSR标记可为牡丹功能基因挖掘、品种分子身份证构建、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供重要的遗传资源。     

苦荞种皮转录组SSR位点信息分析及其分子标记的开发

为开发苦荞新的SSR标记,本研究利用MISA软件对苦荞种皮转录组测序数据进行SSR位点信息搜索,利用Primer 3设计引物并随机选择53对引物进行验证。结果表明:苦荞种皮转录组数据库中共搜索到9 094个SSR位点,其中,单核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重复类型占优势,占总SSR的63.99%、19.35%、15.49%;共发现70种重复基元,其中A/T、AT/AT、AAG/CTT基元是优势基元。设计合成的53对引物中,41对引物(77.36%)获得有效扩增,21对引物具有多态性。本研究从转录组序列中大规模开发的SSR分子标记将有助于苦荞遗传多样性与分子育种研究。     

基于花椒转录组序列SSR分子标记开发及花椒种质鉴定

为拓展分子标记在花椒种质资源分析中的应用、开发花椒EST-SSR功能性分子标记、分析花椒DNA指纹图谱,利用凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组c DNA数据库中45 057条长度大于200 bp的非冗余Unigene序列,使用MIcro SAtellite(MISA)软件搜索SSR位点,分析花椒c DNA序列中SSR位点的频率和密度、SSR重复基元种类及比例、SSR重复次数与数量等分布特征;用Primer 3.0软件在线设计SSR引物并经PCR扩增筛选适合的多态性引物;用Quantity One软件统计多态性条带和分子量大小;NTsys 2.0软件分析12份花椒种质的遗传距离、构建树状聚类图及DNA指纹图谱库。结果表明,45 057条序列中有3 315条Unigene序列包含SSR位点,共3 814个,3 315条序列中SSR位点出现频率为7.07%;在检索出的SSR位点中,二核苷酸、三核苷酸是主要重复类型,分别占29.42%和58.58%,二核苷酸重复中以AG/TC、CT/GA出现频率最高,三核苷酸重复中GAA/CTT、AGA/TCT出现频率最高;二、三、四、五、六核苷酸重复基元总数随着重复次数的增加呈明显下降趋势。利用Primer 3.0设计的64对EST-SSR引物中,55对引物能产生预期片段大小的PCR产物,其中18对引物具有多态性;利用18对引物对12份花椒种质进行PCR扩增,共产生81条扩增条带,其中多态性条带73条,多态率为90.12%;各花椒种质的遗传相似系数为0.552 6~0.894 7,平均为0.725 0;经UPGMA聚类分析在相似系数0.70处12份花椒种质共分为3类,即顶坛花椒为Ⅰ类、竹叶椒为Ⅱ类、其他花椒为Ⅲ类;指纹图谱分析中,8对引物在5份种质中能扩增出特征带型,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开。成功在凤县大红袍花椒的茎尖节点转录组c DNA序列中开发SSR标记,设计并筛选出8对能扩增出特征带型的引物,最少用3对引物进行组合即可将12份花椒种质区分开,这为今后花椒遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面提供新的引物序列并奠定了基础。     

基于转录组测序的鬼针草SSR标记开发及其应用

鬼针草(Bidens bipinnata L.)作为一种重要的药用植物,在属内鉴别和临床用药安全上存在较大问题。本研究利用Trinity软件对鬼针草转录组数据进行组装,共得到总长为106 457 436 bp的120 122条unigenes。利用MISA软件寻找到17 140个含有SSR的重复基元。SSR位点中主要重复序列为单核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的38.73%和38.06%,其次是二核苷酸,占20.73%。利用Primer 3.0设计引物,从中随机选择50对引物进行PCR扩增。其中有28对扩增出清晰条带,多态性好,重复性好。鬼针草转录组的SSR分子标记将会对鬼针草属植物种质资源鉴定、遗传多样性、重要性状基因定位及分子标记辅助选择育种等起重要推动作用。     

基于荧光标记的茶树花转录组序列SSR标记开发

本研究对204 199条茶树花转录组Unigenes进行SSR简单重复序列的查找,得到含有SSR的序列60 581个,出现频率为29.67%。EST-SSR重复类型以单核苷酸和二核苷酸为主,占总SSR比例的85.69%,其中主要重复基序类型为单核苷酸,占总SSR的47.97%,A/T重复类型出现最多。采用荧光标记PCR技术对设计合成的100对SSR引物进行引物筛选,其中有28对引物扩增条带清晰、多态性好,在4个品种的茶树花中得到有效性验证。结果表明,茶树花转录组的SSR标记开发是可行的,这些EST-SSR的开发对茶树花遗传多样性分析、分子育种和开发茶树不育相关的SSR标记等具有重要意义。     

桃(Prunus persica [L.] Batsch)转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选桃(Prunus persica[L.]Batsch)转录组数据,获得的109 248条Unigene,检测出24 102个SSR位点,分布于22 689条Unigene中,出现频率为20.76%。SSRs位点中主导类型是以AG/CT(占总SSRs的18.70%)为主的二核苷酸重复,占总SSRs的33%;其次是三核苷酸重复,出现频率为27%;四核苷酸重复,占总SSRs的25%。利用Primer 5共设计出9 657对SSR引物。随机选择50对引物进行PCR扩增,其中20对扩增出清晰可重复的条带,并且在同属材料(苹果试材)中也能获得理想结果,引物多态性检测发现,在15份桃试材中,10对引物具有多态性,利用UPGMA作图,可将15个桃材料很好区分。结果表明,桃转录组测序产生的Unigene是开发SSR标记的有效信息,为SSR标记在桃的遗传分析上提供可靠的标记选择。     

GenBank数据库中黄麻EST-SSR标记的开发及其通用性评价

本研究从GenBank公共数据库中下载黄麻表达序列标签838条,利用SSRPrimer软件对其进行SSR位点查找,利用Primer 3.0软件设计66对SSR引物,通过琼脂糖凝胶研究这些SSR引物的PCR扩增特点,以检测其多态性。结果表明,66对SSR引物在黄麻属6个不同类型材料的扩增中,42 (63.6%)对引物至少在2个材料之间存在多态性。(AT)n重复基元和(GC-)n丰富的三核苷酸重复基元多态性较高,可作为黄麻SSR标记引物设计的首选。黄麻EST-SSR标记开发效率较高,不仅可以丰富黄麻分子标记的数量,而且为剖析黄麻重要性状的遗传机制奠定基础,这对于黄麻的遗传基础研究具有重要应用价值。     

脆木耳转录组EST-SSR标记特征及多态性分析

为开发脆木耳EST-SSR标记,本试验从脆木耳转录组测序数据挖掘SSR位点,并设计引物对木耳DNA进行多态性分析,为木耳的遗传育种提供理论基础。结果发现,在脆木耳转录组的52 954条unigene序列中共搜寻到4 600个SSR位点,SSR发生频率为6.85%,分布频率为8.69%。脆木耳SSR位点共包括112种重复基元;其中,二核苷酸和三核苷酸重复为主要类型,占SSR总数的92.86%。三核苷酸重复最多(66.64%),其优势重复单元为CCG/GGC (8.71%)。从设计引物中随机挑选30对进行PCR扩增,6对引物在3份木耳种质中均能扩增出清晰的目标条带。本试验所获得的EST-SSR可为木耳种质资源鉴定、遗传结构分析及遗传图谱构建等提供参考。     

RNA-seq技术开发油茶目的基因SSR标记

油茶是中国南方重要的木本油料。利用MISA软件从油茶(Camellia oleifera)果实和叶转录组测序获得的25 297条Unigenes中共搜索挖掘出30 899个SSR标记。在这些SSR标记中,除单核酸苷酸(36.02%)外,主要重复类型是二核苷酸重复(45.79%),其次是三核苷酸重复(16.37%),四以上核苷酸重复占1.81%。Unigenes功能注释中,共648条涉及调控油茶油脂合成和脂肪酸形成积累、产量、花芽分化、生长发育及抗病虫害等目的性状,从这些Unigenes中共搜索挖掘到163个SSR标记,以民玉1号油茶基因组DNA为模板对这些SSR标记的有效性进行初步验证,共筛选出56对具有清晰扩增条带的SSR标记。以选取的5份二倍体油茶种质为材料,对初筛的56对SSR引物进行多态性检测,获得48对具有多态性的SSR标记引物。这些基于高通量数据新开发的油茶目的基因SSR标记可为油茶的指纹图谱构建、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等奠定基础。     

灰毡毛忍冬转录组SSR位点分析及EST-SSR标记开发

灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides)为中药山银花的一种基原植物,在中国南方广泛分布,具有很高的药用价值和经济价值。本研究利用MISA工具对灰毡毛忍冬转录组74 057条Unigenes中的SSR位点进行了分析,其中15 587条Unigene共计含有SSR位点20 161个,SSR发生频率为21.05%。灰毡毛忍冬转录组SSR位点的种类从单核苷酸至六核苷酸重复均有分布,主要重复类型是二核苷酸(9 704个)和三核苷酸(5 847个),分别占SSR总数的48.13%和29.00%,主要重复单元为AG/CT (6 086)、AT/AT (3 071)和A/T(2 826),分别占SSR总数的30.19%、15.23%和14.02%。SSR位点的重复次数分布最多的是6和5次,分别有4 897和3 531个,分别占总SSR数的24.29%和17.51%。利用Primer 6.0软件设计了17 611对SSR引物,随机选出30对引物进行扩增验证,其中14对扩增条带表现出多态性,进而利用这14对引物对6个灰毡毛忍冬品种开展了遗传多样性分析。本研究结果将为灰毡毛忍冬物种鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助育种等提供科学依据。     

薄壳山核桃转录组中的SSR位点信息分析

通过对薄壳山核桃转录组数据的分析,开发新的薄壳山核桃分子标记,为研究薄壳山核桃的遗传多样性、分子标记辅助育种提供科学依据。利用ESTtrimmer和cross-match对转录组测序获得的Unigene进行过滤,除去冗杂序列;利用MISA对无冗余Unigene进行SSR搜索,并应用Primer3进行SSR引物设计。从搜索序列中发现了10 303个SSR,分布于9 871条Unigenes中,出现频率为18.31%,分布密度为1/4.06 kb。二核苷酸和单核苷酸是主要重复类型,分别占SSR总数的44.27%和40.64%;优势重复基元为A/T、AG/CT和AAC/GTT,分别占单核苷酸的39.66%、二核苷酸的35.22%和三核苷酸的4.90%。88.86%的基序长度集中在10~20 bp。成功设计了5 547对SSR引物。通过对薄壳山核桃高通量转录组序列的SSR信息的研究,表明薄壳山核桃转录组SSR位点出现频率高、分布密度大,具有较高的多态性潜能,能提供丰富的重复类型,可以为研究薄壳山核桃的遗传多样性、分子标记辅助育种、遗传图谱绘制等方面提供有效的理论依据。     

基于转录组序列的青榨槭EST-SSR标记开发及通用性分析

青榨槭为目前重要的秋季彩叶园林绿化优良树种之一。本研究基于青榨槭叶片转录组数据进行了SSR标记分析,结果发现其中3 744条unigene序列中含有3 763个SSR位点,发生频率为6.93%,每11.89 kb含一个位点。优势重复序列类型为二核苷酸重复和三核苷酸,分别占总SSR位点的51.21%与46.93%;AG/CT与GAA/TTC分别是二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元。654对引物中252对(38.53%)引物可成功扩增出目的条带,75对(11.47%)引物表现出多态性。75对多态性引物在槭属16个种质间转移率范围为83.75%～100%,平均转移率为90.08%,表明这75对标记具有较高的通用性。利用转录组开发青榨槭SSR标记可为青榨槭以及槭属种质资源研究、分子标记辅助育种等提供重要的遗传资源。     

基于野鸦椿转录组测序的SSR多态性分析

为推动野鸦椿(Euscaphis japonica)遗传多样性研究,以福建乡土树种野鸦椿的转录组序列为基础,对野鸦椿SSR位点进行挖掘。结果表明：通过MISA软件从野鸦椿169 224条Unigenes序列检测出47725个SSR位点,分布于38 802条Unigene中,出现频率为28.20%,平均分布距离为2.46 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的70.27%、18.98%和8.81%。47 725个SSR位点由100种重复基序构成,A/T、AT/AT、AAT/ATT分别是单核苷酸及二、三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的70.17%、8.46%和3.12%。基因GO功能分类表明,含有SSR位点的野鸦椿转录组基因被富集到3个Ontology类别的56个GO Term中,生物学过程涉及的GO Term最多,有25个。利用Primer 3.0对SSR序列设计引物26 554对,成功率为55.64%。野鸦椿转录组SSR位点丰富,分布密度大,具有较高的多态性潜能,可作为开发SSR标记的有效来源,为野鸦椿遗传多样性研究、品种鉴定、分子辅助育种...     

鸟巢蕨EST-SSR标记的开发与应用

为加速分子标记在鸟巢蕨研究中的应用,利用鸟巢蕨EST序列开展了EST-SSR标记的开发和应用研究。利用MISA软件对鸟巢蕨EST序列进行SSR位点查找,分析EST-SSR的总体特征,并利用Primer 3.0软件设计40对引物,选用10份蕨类材料检测引物的多态性。从42 907条鸟巢蕨EST序列中检测到6 067个SSR位点,其出现频率为1/6.62 kb,包括106种重复基元。在鸟巢蕨EST-SSR中,二核苷酸重复(2 873个,47.35%)是最主要的类型,其次是三核苷酸(1 107个,18.25%)和单核苷酸(972个,16.02%)。出现最多的重复基元是AG/TC(1 371个,22.60%),其次是CA/GT(1 066个,17.57%)和A/T(628个,10.35%)。设计合成了40对EST-SSR引物对10份蕨类材料进行PCR扩增,26对引物能扩增出明显条带,其中17对引物扩增出了65条多态性条带,平均每对引物多态性带为3.82条。遗传分析表明,10份蕨类材料之间的遗传相似系数为0.338~0.815,可将供试蕨类材料分为2个类群。从鸟巢蕨EST序列中开发SSR标记是有效和可行的,开发的EST-SSR引物可用于蕨类植物遗传分析研究。     

鸭茅基因组Genomic-SSR标记开发

鸭茅是重要的冷季型禾本科牧草,而优质分子标记的缺乏制约了鸭茅分子育种的进程。本研究从鸭茅基因组序列中鉴定出78 984个SSR位点,其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的SSR类型共占98.1%。共鉴定出212种重复基元,A/T、AG/CT、CCG/CGG、AGAT/ATCT、AAAAG/CTTTT和AGAGAT/ATCTCT分别为各重复类型中最丰富的重复基元。通过鉴定出的SSR位点开发出67 216对Genomic-SSR引物,选取50对进行验证试验,其扩增成功率达94%,多态性比例44%。通过开发的Genomic-SSR引物和EST-SSR引物在20个鸭茅品种(系)中进行试验,得到其引物多态性信息含量(PIC)平均值为0.370,分子标记指数(MI)为2.86。以上数据均高于通过鸭茅转录组开发的EST-SSR标记。证明本试验所开发的大量genomic-SSR标记是扩增成功率高、多态性强且高效率的分子标记,有望在鸭茅分子育种中发挥重要作用。