水稻OsAPX1基因在烟草中的表达及其抗盐性研究

本研究采用RT-PCR方法克隆得到水稻细胞质抗坏血酸过氧化物酶(OsAPX1)基因全长cDNA(基因登录号:D45423);将该基因构建二元植物表达载体pBI121-OsAPX1;用农杆菌EHA105侵染介导烟草叶盘转化法转基因,获得转基因植株,PCR鉴定遗传转化的烟草植株成功地整合了水稻OsAPX1基因;Northern blot鉴定结果表明转基因T1代植株Ta在mRNA转录水平上表达;对Ta株系进行Kana抗性鉴定,表明转基因T2代株系有抗性;对T2代株系做NaCl、NaHCO3、Na2CO3抗盐性鉴定,结果表明与对照相比表现出转基因植株抗(耐)性提高;取T2代植株的叶片在不同浓度H2O2处理下,抗H2O2毒害的能力显著强于对照,转基因植物的抗性有所提高,有望在抗盐碱性育种上应用.     

外源钾通道基因在水稻中的表达及其钾吸收特征研究

通过基因枪导入法,将外源钾通道基因导入水稻中花8号、中花9号、中花13以及8706中表达,获得了转基因植株.经PCR和Southern检测,共获得42个表达了钾通道基因的转基因株系.通过二代的筛选并获得了部分株系的纯合系.转基因植株对钾的吸收累积试验表明,与对照相比,供试转基因株系的吸钾速率和对钾的累积能力都有明显提高.研究表明     

玉米ppc基因过表达对转基因水稻光合速率的影响

通过转基因技术将外源ppc基因导入水稻以期增加产量是国内外的重要研究领域。然而,关于ppc基因过表达能否提高转基因水稻的光合速率至今尚无定论。本研究将玉米ppc基因导入水稻中花8号,获得大量转基因水稻植株。经PCR筛选、PEPC活性测定、Southern和Western杂交分析,表明玉米ppc基因已经整合到受体水稻基因组中,并得到了正确和高效的表达。测定了温室内种植的T₁代6个PEPC活性不同的转基因水稻植株的光合速率,只有活性最高的株系的光合速率显著增加,增加的幅度为27.3%。在旱作栽培条件下测定了T₃代33个转基因株系的光合速率,结果表明在高温、高光强下,绝大多数转基因水稻的光合速率增加,最大提高了68.8%。比较6个转基因株系的T₁和T₃代看到,逆境胁迫条件下转基因水稻光合速率明显提高。以上结果表明水稻中导入ppc基因可以提高其光合速率,特别是逆境条件下的光合速率。     

外源基因在苹果转基因植株的稳定性研究

以继代培养13年的转豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因和新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因苹果嘎拉、王林、乔纳金和富士组培苗及田间定植6～8年的转基因植株为试材,应用卡那霉素筛选和PCR扩增分析对外源基因的稳定性进行研究。结果表明,在57个苹果转基因株系组培苗中均可检测出CpTI特异基因片断;转化株系在添加50mg/L卡那霉素的培养基中生长正常。田间株系PCR检测结果表明,转入的外源CpTI基因在所测株系的叶片、花粉及大部分根系中稳定存在,有极少数株系的根系中未检测到特异表达条带。结果说明外源基因可以在转基因植株中稳定存在,但在不定根发生过程中有可能会丢失。     

过量表达OsYUC2转基因水稻幼苗对干旱和H2O2胁迫的生长生理应答

OsYUC2基因是控制水稻生长素合成的关键基因家族OsYUCs成员之一。本研究以过量表达pUbi-OsYUC2-GUS转基因水稻(G3株系)和野生型水稻(WT,Oryza sativa L .sppj.aponica,v.nipponbare,日本晴)为材料,分别比较了二者在干旱和 H2O2 胁迫下生长生理的变化。结果显示,20%PEG-6000和0.06% H2O2 处理条件下,G3的株高、初生根上侧根的长度(特别是不定根上侧根的数量和长度)都大于WT的;而G3的MDA和H2O2积累量则都少于WT的。与对照组比,PEG和H2O2处理后G3根系的GUS活性都降低且由均匀分布变为梯度分布,说明PEG和H2O2影响OsYUC2基因的表达部位和空间分布。相同处理条件下,G3根系与DR5-GUS转基因水稻根系GUS活性和分布样式的变化类似,显示PEG和H2O2减少生长素的积累并影响其梯度分布。OsYUC2过量表达在一定程度上缓解了由于PEG和 H2O2 胁迫导致生长素减少引起的伤害,转基因水稻幼苗的抗逆水平有所提高。     

转抗真菌基因水稻几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的时间变化

为了研究外源几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因在水稻植株上表达的时间变化规律,利用酶促反应结合3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定了4个转基因水稻株系不同生育期叶片中几丁质酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性。结果表明,无论是亲本还是转基因株系,2种酶活性随生育期的后延而增大。生育前期,转基因株系的2种酶活性与亲本的酶活性水平差异小,随生育期的后延,与亲本酶活性的差异越来越大,说明外源基因前期表达量小甚至沉默或抑制内源基因的表达,后期表达量多。同时转基因株系的酶活性的波动性较亲本的大,且酶活性的高低与转入基因数量无相关性。因此,外源基因的表达具有时效性但不具有数量优势。     

3个抗虫耐盐基因载体对烟草的遗传转化及表达分析

病虫害和土壤盐渍化是影响烟草生长发育的重要因素,转基因技术已成为改善这一现状的有效手段。本研究将部分改造的Bt基因Cry1Ac基因、Cry3A基因及NTHK1基因构建在同一载体上,利用农杆菌介导法转化野生烟草植株。经PCR检测,获得10个转基因株系。经荧光定量PCR检测,Cry1Ac基因表达量在104~10~5数量级,1号转录丰度1.58×10~5为最高,而Cry3A基因表达量在10~5~10~6数量级,10号转录丰度1.34×10~6为最高;10个转基因株系双Bt基因均得到表达且存在表达差异,而对照烟草没有Bt基因表达。经ELISA检测,转基因烟草Cry1Ac蛋白平均表达量为150.441 ng/g,变化在0.86~201.74 ng/g;Cry3A蛋白平均表达量为1 192.592 ng/g,变化在23.33~2413.47 ng/g。经过对烟草斜纹夜蛾的虫试,初步证明转基因植株获得了抗虫性。组培苗耐盐试验表明,不同盐浓度条件下,转基因株系的分化状况优于对照。证明抗虫耐盐多基因的一次性转化,可提高烟草的抗虫能力和耐盐性。     

转录因子OsHOX4过量表达及T1代转基因植株中纯合系鉴定

OsHOX4基因是属于水稻植物同源结构域(HD-Zip)转录因子家族的一个成员。本研究利用农杆菌介导法将OsHOX4基因转入籼稻(Oryza sativa ssp.indica)IR64中,获得54株过量表达植株。我们利用southern杂交分析确定了各个株系的拷贝数后,利用TAIL-PCR方法对4个不同的单拷贝株系进行了研究,并在其中找出T-DNA在3个单拷贝株系染色体上的插入位点(分别为染色体5,8,10)。根据T-DNA在各个株系的插入位点分别设计特异性引物,从T1代转基因株系里鉴定出纯合的植株。我们观察到OsHOX4过量表达植株的分蘖数明显高于野生型,株高比野生型明显的变矮,在同一个株系的纯合和杂合的转基因植株表型也有很大的差异。在TAIL-PCR分析基础上,为从T1代转基因作物中鉴定出纯合的植株提供了方法和理论依据。     

转大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白GmNHX1基因植株的获得

制约大豆生产的因素很多,土壤盐渍化就是其中之一。大量研究证明过表达NHX逆向转运蛋白可以提高植物的耐盐性。为获得耐盐性良好的转基因大豆材料,我们将大豆Na~+/H~+逆向转运蛋白(GmNHX1)基因构建到植物表达载体pCAMBIA3300上,应用农杆菌介导法将GmNHX1导入大豆品种黑农56和黑农59中,共获得18个转基因株系,并对T_1代转基因株系进行了PCR和实时荧光定量PCR检测。PCR结果表明转基因后代株系呈阳性的植株有4株;经Real-time PCR检测该4个PCR阳性转基因株系的G NHX1基因表达水平均高于对照株系;200 mmol/L NaCl溶液的盐试结果表明;对照植株的生长速度滞缓于4个转基因株系的生长速度。     

过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性

拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性.为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株.对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排；纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性.     

DREB1B基因在转基因小麦后代的稳定表达

本研究对基因枪导入了pBAC128F/R质粒(含有玉米Adh1内含子1的CaMV35S启动子驱动的bar基因作为选择标记,以来自拟南芥菜逆境诱导表达类型--亲水蛋白rd29b基因的启动子驱动脱水应答转录因子DREBIB基因的逆境诱导表达类型质粒)的T4代转基因小麦进行了稳定表达研究.PCR、PCR-Southem和Southern杂交分析表明,外源转录因子DREBlB基因已稳定整合到转基因株系的基因组中.半定量RT-PCR结果表明,部分转基因株系的DREB1B基因的相对表达量有所增强.叶片除草剂抗性检测结果显示有8个转基因株系可抗到150 mg/L.叶片脯氨酸含量测定结果表明,有4个株系(编号为1,18,30和76)的脯氨酸含量提高幅度较大,同一株系,干旱与未干旱处理相比,脯氨酸含量提高了3～5倍.干旱处理后的转基因植株与非转基因植株相比,脯氨酸含量高2～3倍.在干旱条件下,T4代田间小区产量统计数据分析结果表明,有4个转基因株系(编号为30,51,70和76)的产量与非转基因植株相比有显著增加.研究表明,利用逆境诱导型rd29b基因的启动子来增强外源DREB1B基因的表达,能显著改良小麦的抗旱性.     

利用AH1基因的遗传转化改良紫花苜蓿耐盐性

由于盐胁迫严重限制了苜蓿的产量,研究构建了沙打旺(Astragalus adsurgens Pall)解螺旋酶基因AH1的植物表达载体p Cambia-AH1,并利用农杆菌介导法将目的基因转化到紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中,旨在获得抗盐胁迫能力强的转基因植株。半定量RT-PCR检测和Northern杂交表明AH1基因在5个转基因株系中稳定表达。在盐胁迫条件下,与野生型对照植株相比,AH1转基因株系对中度盐胁迫(200 mmol/L Na Cl)具有较强的耐受性。而且,在中度盐胁迫条件下(200 mmol/L Na Cl),转基因植株累积了大量的游离脯氨酸和可溶糖。研究表明AH1基因可以改善植物盐渗透调节能力,从而导致了AH1转基因植株的抗盐胁迫能力的提高。     

转金属硫蛋白基因(MT1)烟草抗Cd2+胁迫的生理特性分析

将柽柳(Tamarixsp.)金属硫蛋白基因(MT1,GenBank登录号:AB298390)插入植物表达载体pBI121,取代花椰菜病毒35S启动子下游的gus基因,利用农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导法将MT1导入烟草(Nicotiana tobacum)基因组。对具有卡那霉素抗性,且经PCR-Southern检测和Northern杂交表现阳性的转基因株系进行抗Cd2 分析表明,金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因植株的抗Cd2 能力,在含200μmol L-1和400μmol L-1Cd2 的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株MDA含量及POD活性明显低于非转基因株系,叶绿素含量和SOD活性比非转基因株系明显增加。     

超表达OsPup1基因可提高烟草低磷胁迫及减轻铝毒性

磷是植物生长的必需元素之一,对植物生长发育、生理代谢、产量与品质形成起着十分重要作用。研究耐低磷植物,有助于提高作物产量,降低化肥用量,提高化肥利用率。本研究通过在不同供磷条件下对转OsPup1基因植株的形态进行研究,阐明该基因在不同供磷水平对植株生长特性的影响。通过农杆菌介导法将OsPup1基因遗传转化烟草,经抗性筛选和PCR鉴定获得转基因植株。对不同转基因烟草株系,设置4个磷水平处理进行耐磷性及铝毒性分析。结果显示,转OsPup1基因烟草以0.25 mmol/L KH2PO4作为低磷处理较适合,与野生型植株相比,转基因株系植株根系数量增多,主侧根增加。在低磷胁迫及三氯化铝(Al Cl3)处理条件下转OsPup1基因烟草的生长情况明显优于野生型植株。说明转OsPup1基因对环境中的低磷胁迫逆境能产生明显应答,初步推断OsPup1基因的表达,具有增加植株根系,改善植株生长状态和延缓铝毒的生物学功能。本研究表明,OsPup1基因在介导植株不同供磷水平下的根叶形态建成发挥着重要作用。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

烟草(Nicotiana tabacum)生长素响应基因NtIAA27的克隆及功能分析

为了研究内源生长素信号路径对烟草烟碱合成的调控,本研究根据烟草基因组数据和PCR扩增获得烟草生长素响应蛋白NtIAA27基因RNAi干扰片段180 bp,将该基因180 bp的片段克隆至RNAi载体pHellsgate12中,并通过叶盘法将该基因转入烟草K326中。经过实时定量PCR检测获得两株敲除效率较高的转基因植株,对这两株转基因株系及非转基因材料进行烟碱含量测定,结果表明与非转基因植株相比,RNAi转基因植株的烟碱含量升高,表明内源生长素信号路径可以负调控烟草烟碱含量,本研究将为培育不同烟碱含量的烟草品种提供有价值的信息。     

水稻类受体激酶OsBRR1对稻瘟病抗性分析

基因OsBRR1是LRR-RLKs基因家族中的一员,LRR-RLKs的成员大多参与调控植物的生长发育以及防卫反应.本研究分别对OsBRR1的转基因干涉株系和超表达株系进行了稻瘟病抗病鉴定.结果显示,转基因干涉株系比转空载体和野生型对照株系对具有中等毒性的稻瘟病菌株研54-04显示更强的感病性;而超表达株系对三种不同的强...     

水稻转录因子基因SUSIRI的过表达及RNA干扰对水稻分子及表型效应的分析

在克隆到水稻转录因子基因SUSIRI的基础上,构建其过表达及RNA干扰载体进行水稻的遗传转化。由潮霉素筛选及分子检测得到的T0代植株经大田栽植,共有34株过表达及46株RNA干扰植株获得T1代转基因种子。继续种植T1植株收获T2代种子,同时用半定量RT-PCR分析苗期及穗期野生型水稻中SUSIRI基因的时空表达谱并比较过表达及RNA干扰植株的SUSIRI基因在叶片及幼穗中的表达状况,发现过表达植株与野生型对照的基因表达基本相同,但RNA干扰植株的表达受到明显抑制。对过表达及RNA干扰植株稻穗性状考察表明:与野生型对照相比,无论是过表达还是RNA干扰,转基因植株的穗粒数、结实率降低,RNA干扰植株表现得尤为严重(P<0.05),但对水稻谷粒粒重的影响并不显著(P>0.05)。SUSIRI基因的过表达未出现使稻穗性状明显改良的株系,而RNA干扰会导致水稻的结实能力严重降低。     

中国水仙凝集素基因在大花烟草中的定量表达及抗蚜性分析

为了确定中国水仙凝集素基因NTL1的抗蚜功能及培育具有抗蚜功能的大花烟草,利用qPCR方法,研究了中国水仙凝集素基因(NTL1)在转基因大花烟草4个株系中的相对表达情况;利用自然感蚜、活体接种和离体接种方法研究了不同转基因株系的抗蚜能力。结果表明,NTL1在不同株系中的相对表达量差异显著,从高到低依次为3,4,1,2;抗蚜虫试验结果显示:转基因烟草具有一定抗蚜性,但不同烟草株系的抗蚜能力有所不同;活体转基因烟草单株与离体烟草叶片的平均蚜虫密度抑制率分别为8.22%~76.61%,4.62%~65.65%;转基因大花烟草可加速蚜虫的死亡。对比NTL1在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量及抗蚜效果,发现NTL1在不同株系中的相对表达量与植株抗蚜性具有高度一致性。     

农杆菌介导的辽宁碱蓬胆碱单氧化酶基因CMO转化烟草提高抗氧化胁迫的研究

通过农杆菌介导的遗传转化,将来自辽宁碱蓬的甜菜碱合成关键基因－胆碱单氧化酶基因CMO 转入烟草,以提高烟草耐受氧化胁迫的能力,并对得到抗生素抗性植株进行了分子检测和百草枯诱导 的氧化胁迫。Southern 和Northern 检测表明CMO 已经整合到烟草基因组中,并得到了正确的表达,但 不同转基因株系中的拷贝数不同,株系T1、T2、T6 为单拷贝;株系T4、T5 为双拷贝;株系T3 为3 个拷 贝。在10 μM 和20 μM百草枯胁迫24 h 的情况下,转基因植株表现了较强的耐受氧化胁迫能力,各转 基因株系和野生型相比具有较低的丙二醛含量和较高的超氧化物歧化酶活性。这可能是转基因植物 中甜菜碱的积累诱导或保护了抗氧化酶的活性,使得转基因植株受到的氧化胁迫较低,转基因植株中 较低的电导率也证明了这一点。转CMO 基因烟草耐氧化胁迫能力的提高,说明CMO 基因可以进一步 在玉米、水稻等重要农作物中应用以提高其耐受干旱、低温等非生物胁迫的能力。