核酸染料Gelred在两种凝胶检测系统中的应用研究

由于无毒的核酸染料Gelred价格比较昂贵,在不影响实验效果的情况下,探讨Gelred在聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳中的最小用量。笔者将10000×的核酸染料Gelred稀释成1×、10×、20×、30×、40×、50×,将稀释后的核酸染料直接加入到甜菜PCR产物中。将核酸染料和甜菜PCR产物的混合物直接点样聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,电泳后直接利用凝胶成像系统进行检测。以及另外一种方法是利用1×的Gelred分别对聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶进行泡胶,用凝胶成像系统进行检测。结果表明,Gelred 30×及以上的稀释浓度均适合于聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶,而1×的Gelred稀释液更适合于对聚丙烯酰胺凝胶进行泡胶。将稀释后的Gelred直接和PCR产物混合后,配合聚丙烯酰胺凝胶电泳,不仅减少了Gelred的使用量,而且减少了显影的时间。     

核酸染料UltraPowerTM和G-Red对聚丙烯酰胺凝胶DNA的四种染色方法比较

在聚丙烯酰胺凝胶法检测DNA过程中,核酸染料一旦与DNA结合其荧光量子急剧增加,在紫外光或者可见光的照射下就可以观测到DNA。但目前尚无核酸染料对聚丙烯酰胺凝胶中DNA不同染色方法的比较研究。本研究比较了UltraPower^TM和G-Red两种无毒核酸染料对聚丙烯酰胺凝胶法检测DNA的四种染色方法(点染,胶染,点染+胶染,泡染),结果表明：UltraPower^TM和G-Red两种核酸染料通过泡染法成功检测到凝胶中的大小片段DNA,条带清晰易辨;DNA检测灵敏性高,都在80 pg以下;染色过程安全简单,只需要一种无毒核酸染料和一个染色步骤。但UltraPower^TM检测DNA条带的灵敏性(19.53 pg)是G-Red的4倍(78.13 pg),而每块胶DNA染色成本(2.65元)仅是后者的1/2 (5.30元)。从经济和DNA检测灵敏性两方面考虑,UltraPower^TM染色比G-Red更胜一筹。核酸染料泡染法将促进聚丙烯酰胺凝胶中DNA的高效灵敏检测。     

RAMP与REMAP分子标记技术及其应用

引物设计是RAMP和REMAP标记分析的关键,二者都使用锚定的微卫星序列引物。目前已开发出多个RAMP锚定微卫星序列引物,与不同的RAPD引物进行扩增,得到更多的引物组合。REMAP使用反转录转座子的外向LTR引物和锚定微卫星序列引物。而RAMP分析采用不对称PCR循环,在PCR扩增的后15个循环中,退火温度设为2个;REMAP则采用常规PCR循环。扩增产物可在聚丙烯酰胺凝胶、变性聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶上进行电泳分离,检测时可使用同位素、银染或溴化乙锭染色等技术。目前,这两种标记技术已在作物和动物种质资源的遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建、转基因植株基因稳定性分析等方面都有成功的应用。     

SSR扩增产物检测方法比较及其实验操作注意事项

介绍了琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光标记毛细管电泳等几种PCR扩增产物检测的方法,比较了各自的优缺点,指出了应用这些方法实验操作过程中的注意事项,建议采纳试验结果精确度高、操作简便、高效的荧光标记毛细管电泳方法.     

微卫星荧光标记基因分型实验误差控制

分子标记基因分型误差对研究结果的影响越来越为研究者们所关注。本研究以茄子（Solanum melongena L.）野生和栽培类群为研究材料,从微卫星荧光基因分型中PCR扩增实验体系和荧光标记判读两个环节控制实验的误差率,总结出一套简便、快速的微卫星分子标记PCR扩增实验优化流程;并且,针对微卫星荧光标记基因分型中存在的各种误差,提出相应的分析方法和检测方案,为利用微卫星分子标记技术的研究提供实验操作依据和数据处理参考。     

绿盲蝽取食诱导赤霞珠冬芽全蛋白双向电泳体系的建立与优化

建立绿盲蝽取食胁迫下赤霞珠冬芽防御反应的蛋白质组学双向电泳技术体系,旨在为后续筛选和分析差异蛋白相关研究提供参考。选取赤霞珠葡萄冬芽,分别设置绿盲蝽取食胁迫和空白对照试验,于24 h后采集样品用液氮带回,-80℃冻存;利用TCA-丙酮法、TCA-丙酮法+酚抽提法提取粗蛋白干粉;利用CBB G-250染色法进行蛋白质浓度测定;确定上样量及凝胶染色技术。扫描得到凝胶图像,进行对比分析。结果显示,利用不同蛋白质提取方法均可获得双向电泳所需粗蛋白,采用TCA-丙酮法获取的粗蛋白量明显多于TCA-丙酮法+酚抽提法;2种方法所提取的全蛋白浓度差异较大,TCA-丙酮法操作更为简便,蛋白丢失少。不同上样量对双向电泳图谱效果的影响差异显著,400μg蛋白上样量比800μg所得的凝胶图片上的蛋白点清晰,易于分离。考马斯亮蓝染色结果表明,R-350更适用于葡萄冬芽全蛋白双向凝胶电泳技术。利用TCA-丙酮法抽提蛋白,400μg蛋白上样,pH值4～7 NL 17 cm的IPG胶条,G-350热染色双向电泳技术体系得到的赤霞珠冬芽全蛋白凝胶图谱,符合绿盲蝽取食诱导赤霞珠防御反应产生防御蛋白的检测要求。     

果蝇卵巢管经固定和染色后的荧光效果研究

为进一步研究不同生物材料的荧光染色特性,开辟荧光组织学的新领域,以黑腹果蝇卵巢为实验材料,解剖取出雌果蝇的卵巢管,通过不固定直接压片、用多聚甲醛固定液固定后压片及固定后再用不同染料染色后压片这3种方法处理后,分别在明场（白光）、绿色激发光、蓝色激发光和紫外激发光下观察、拍照。发现果蝇的卵巢管具有弱的自发荧光性,多聚甲醛可赋予卵巢管明显的荧光特性,固定后的标本经不同染料染色后荧光性分别出现不同的显著变化。通过综合分析认为,常规固定剂及染色剂可以分别赋予果蝇卵巢管中的生殖细胞和体细胞各自不同的荧光特性,也可赋予细胞内不同物质成份以各自不同的荧光特性。不同固定、染色剂赋予生物组织细胞新荧光特性的研究在组织学中将会有重要而广阔的应用前景。     

棉花微卫星DNA扩增产物检测方法的优化研究

以棉花两个多标记基因系F582和F586及其后代为材料,对微卫星DNA的PCR扩增产物检测方法进行了优化研究。结果表明：检测微卫星DNA,聚丙烯酰胺银染灵敏度高于琼脂糖EB染色;聚丙烯酰胺凝胶的浓度需随着待测SSR序列的片段大小而作适当调整,一般情况下聚丙烯酰胺凝胶的浓度以6％为宜,但当待检测的DNA片段小到100bp～250bp的区域范围时,凝胶的浓度需提高到8％。胶板样品上样量以3μl为宜。在显色液预冷(约10℃)的前提下,显色的时间应控制在4min之内,以便得到的胶板DNA条带强度适中、对比度好。     

利用SSR快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的研究

为了建立一套快速鉴定甜菜品种纯度和真实性的实验体系,对DNA的提取、检测、PCR反应体系、程序、电泳以及显影方法等多个方面进行了优化, 最终确立了一套简单、快速、节约、污染小的甜菜品种纯度和真实性的鉴定体系。该方法使用96孔PCR板,利用碱裂解法提取干种子（或者叶片干粉）DNA;使用无毒的Gelred替代致癌性的EB,利用λ DNA检测提取样品DNA的浓度; PCR反应的体系为5μL,使用多重PCR替代单一PCR;PCR反应程序为94℃变性15s,退火15s,72℃延伸30秒,30个循环,最后72℃延伸5min; PCR产物的分离使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,最后使用快速银染法对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行显影。利用优化后的程序,一个成熟的实验室操作人员只需一天就可以完成192份样品的检测。     

实时荧光定量PCR技术及其在水产上的应用

摘要：实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上结合荧光染料发展起来的一种核酸定量技术,能快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测,已被广泛应用于生命科学的各领域。本文就实时荧光定量PCR的检测原理、荧光染料,管家基因以及其在水产上的应用作一阐述。     

扁吻鱼微卫星分子标记的筛选及特征分析

通过磁珠富集法筛选扁吻鱼的微卫星分子标记。利用限制性内切酶Sau3AI对扁吻鱼的基因组DNA进行酶切,并选取片段大小在250～750 bp间的片段,利用PCR技术进行全基因组扩增,采用生物素标记的(CA)8探针对微卫星片段进行富集。富集后的片段与T载体连接后利用DH5α大肠杆菌进行转化,然后以Sau3AI为引物对菌落进行PCR扩增,扩增后选片段大小符合条件的菌落挑取至测序板,进行测序。结果表明:PCR筛选共获得563个阳性克隆,其中测序192个阳性克隆后发现有53个微卫星序列;序列分析表明,完美型占67.92%,非完美型为22.64%;混合性标记占9.43%。根据测序结果设计微卫星引物24对,经PCR扩增筛选,琼脂糖凝胶电泳结果显示,其中22对引物可扩增出清晰的条带,其中具有多态性的13对。利用13对多态性引物对扁吻鱼野生群体进行扩增,PCR扩增结果显示,等位基因数为3～6,多态信息含量(PIC)为0.625 3,12个位点处于高度多态水平(PIC>0.5)。     

甜菜SSR扩增产物不同检测方法的比较研究

利用16对甜菜SSR引物对12个不同的甜菜品种进行扩增,分别采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、3%的Metaphor琼脂糖电泳以及3%的普通琼脂糖电泳对SSR扩增产物进行检测,比较不同检测结果的差异性。结果表明,8%的非变性聚丙烯凝胶分辨细小条带的差异远高于3%的Metaphor琼脂糖和普通琼脂糖,而Metaphor琼脂糖的的分辨率高于普通琼脂糖,但对于条带较少的引物,三种凝胶未显现出差异;对于条带数较多的引物,如果条带比较集中,三种检测方法差异显著,如果条带比较分散,三种凝胶之间的差异较小。由于Metaphor琼脂糖价格偏高、胶软不易操作且分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶,因此不建议使用。而8%的聚丙烯酰胺凝胶则适合于指纹图谱的构建以及遗传多样性分析等等,普通琼脂糖可以应用在品种纯度的鉴定。     

牡丹种子总RNA提取方法比较

采用CTAB法、Trizol法及改进的RNA提取试剂盒方法提取牡丹种子的总RNA,比较三种方法的优劣,从而筛选出一种适合于牡丹种子高质量RNA的提取方法。结果表明,以RNA提取试剂盒为基础,当每管样品是25 mg(700μL裂解液)时,六管合一管过吸附柱的方法操作简单,且能够有效地去除牡丹种子中脂肪、多糖、多酚等代谢物质,从而提取出高质量的RNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示该法提取的RNA完整性好,紫外分光光度计检测其OD260/OD280比值为2.03。而且,该法提取得到的RNA被成功应用于荧光定量PCR表达分析等后续的分子生物学研究。     

不同方法测定花生花粉活力的比较研究

为筛选适合花生花粉活力快速检测的方法,采用TTC染色法、卡宝品红染色法、醋酸洋红染色法、I₂-KI染色法、红墨水染色法以及离体萌发法等6种方法测定花育23、四粒红和吉花23的花粉活力。结果表明,不同测定方法间存在显著差异(p<0.05),TTC染色法不能使花粉着色,测定结果均为0;卡宝品红染色法和醋酸洋红染色法测定结果显著高于其他测定方法(p<0.05);离体萌发法直观准确,但操作复杂、费时;I₂-KI染色法和红墨水染色法操作简单、染色效果明显,是较好的花生花粉活力快速检测方法,其中红墨水染色法的测定结果最接近离体萌发法。综合比较6种测定方法,红墨水染色法可用于花生花粉活力的快速检测。     

基于FLUOstar平台的小麦dsDNA荧光定量与基因型分析

双链DNA(dsDNA)定量分析是植物分子生物学研究的基础,对基因型分析尤为重要。本研究以λ噬菌体dsDNA为标准样品,建立了荧光定量标准曲线,探讨荧光核酸定量通量性及其与紫外法定量的差异,并分析荧光染料在基因分型中的应用。结果表明,荧光染料能够对dsDNA进行高效微量定量分析(1.1ngmL-1),但因鉴定核酸的浓度较低,对小麦籽粒和叶片全基因组DNA定量时稀释倍数较大,易增大浓度误差。降低反应体系量导致标准曲线决定系数降低,影响测量准确性。精确定量dsDNA浓度时,总反应体系应大于200mL;对PCR产物进行基因分型时,总反应体系应不低于40mL。相同DNA模板浓度下,FLUOstar平台可以对抗秆锈病基因显性标记csSr32#1(Sr32)和IB-267(Sr50)的PCR产物进行基因型分型,判断准确率为100%。对特异性强且等位基因片段差异大(≥100bp)的共显性标记,如抗叶锈病基因标记We173(Yr26)等,用荧光染料同样可以进行基因分型。与琼脂糖凝胶电泳相比,荧光染料鉴定等位基因价格略高,但方法简单、准确快速、重现性好,可用于分子育种中世代材料快速筛选。     

大豆花粉活力测定方法的比较研究

为研究不同方法测定大豆花粉活力的问题,选取‘绥农4’、‘吉林47’和‘CK-P’为研究对象,通过蔗糖、琼脂、硼酸、温度单因子正交试验筛选出的培养基进行离体萌发,比较I2-KI染色法、TTC染色法和离体萌发法3种花粉活力测定方法的不同。结果表明:I2-KI染色法容易操作,因这种方法较离体萌发法简单,测定结果比较准确,成本低,所需时间短,常用来观测大豆花粉活力。TTC法染色效果与I2-KI染色法接近,没有差异,也可作为检测大豆花粉活力的方法。离体萌发法测定大豆花粉活力的方法和很多因素有关,与I2-KI染色法和TTC染色法有显著差异,且其培养基的配制繁琐,所以用I2-KI染色法和TTC染色法来测定大豆的花粉活力。     

利用流式细胞仪鉴定植物倍性的研讨

为建立一套利用流式细胞仪快速鉴定多种植物倍性的通用型方法,以黑果枸杞(L. ruthenicum)和甜叶菊(S. rebaudiana)不同倍性植株为实验材料,通过比较不同细胞裂解液解离效果、染色液作用效果、植株培养条件,应用流式细胞仪对不同倍性植株细胞核DNA进行检测。结果表明,使用Nuclei Extraction Buffer,DAPI染色液,处理两种植物试管苗,获得的细胞裂解液经BD流式细胞仪检测,样本细胞核DNA成峰集中,细胞核及细胞碎片少。利用此方法进行倍性鉴定,具有简便、快捷、高效的特点,可在短时间内处理大量样本,且实验重复性好,也为利用流式细胞仪鉴定其他物种的不同倍性植物样品提供了依据。     

两种凝胶电泳系统对SSR标记多态性的影响

利用 35个SSR引物和 14个玉米自交系直接比较了 3%Metaphor琼脂糖凝胶和 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳对SSR位点多态性水平的影响。结果表明 ,两种凝胶系统检测出的等位基因数目和基因多态性水平存在显著差异 ,12 %聚丙烯酰胺凝胶在区分微小差异片段能力上明显高于 3%Metaphor琼脂糖凝胶。另一方面在两种电泳检测系统下 ,14个自交系之间的遗传相似系数相关性 (r =0 516)达到了极显著水平 (P <0 0 1)。在 10个具有最大多态性信息量的SSR引物中 ,8个在两种凝胶系统中保持相同。利用 8个引物可以对供试自交系进行初步鉴定。笔者认为 ,3%Metaphor琼脂糖凝胶电泳比较适合在遗传作图或基因定位研究中应用 ;而在品种指纹图谱分析或遗传多样性研究中 ,应采用 12 %聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测工具     

奶粉中阪崎肠杆菌检测方法的比较研究

奶粉中的阪崎肠杆菌对人类的危害性很大,采用荧光PCR检测法、传统检验法和FDA法3种不同的检测方法对贝因美A婴儿奶粉进行了检测,将检测结果进行比较分析得出,荧光PCR检测法所用时间最短,灵敏度较高。     

玉米简易多重SSR-PCR和荧光标记检测技术

玉米是世界重要的粮食和饲料作物,通过深入研究玉米分子育种技术来提高玉米产量显得尤为必要。为了获得快速、高效的玉米DNA分子标记检测技术,本研究以玉米为试验材料,开发出一套简易、快捷的多重SSR-PCR技术和荧光标记检测方法。结果表明:2次SSR-PCR反应和1次毛细管电泳荧光检测,可以鉴定11对二等位基因多态引物,扩增方面与常规PCR反应相比效率提高了5.5倍,基因型检测方面与常规聚丙烯凝胶电泳相比效率提高11倍。利用扩增试剂盒(Mutiplex)的多重PCR扩增方法简单、稳定,取得了比较理想的玉米SSR快速高效的标记检测效果,适于在不同实验室移植。