银杏褐化与非褐化愈伤组织的转录组分析

本研究利用环境扫描电子显微镜和高通量测序技术对银杏褐化和非褐化愈伤组织进行细胞结构观察与转录组测序,以探索愈伤组织的褐化机理。扫描电镜观察显示非褐变的愈伤组织细胞排列均匀,褐变愈伤组织的细胞表现出紊乱,排列松散无序。对褐化和非褐化愈伤组织共计6个样品进行了转录组测序,共获得45.66 Gb Clean Reads,各样品Clean Reads均达到6.41 Gb以上。对褐化与非褐化愈伤组织的基因进行差异分析,结果发现分别有275和153个基因上调和下调表达。转录因子分析发现相较于非褐化愈伤组织,褐化愈伤组织中MYB、AP2和NAC等转录因子表达量上调,HD-ZIP下调。KEGG功能富集分析结果表明差异表达基因显著富集在苯丙烷代谢途径,PAL和CCR基因上调表达增加了酚酸的合成与代谢,推测苯丙烷生物代谢途径部分基因表达量上调导致酚酸类化合物的积累,可能是银杏愈伤组织褐化的主要原因。本研究通过扫描电镜观察和转录组测序,为解析银杏愈伤组织褐化的分子机制提供理论依据。     

皂荚类胡萝卜素合成途径基因表达分析及miRNA调控的鉴定

皂荚是豆科皂荚属落叶乔木,具有较高的生态价值和药用价值。研究相关基因的表达、调控及功能,是分子改良植物的重要前提,而目前对皂荚基因表达调控的研究鲜有报道。为了探究皂荚荚果成熟过程中类胡萝卜素合成途径的基因表达和调控,本研究基于皂荚荚果两个不同发育期(7月, 9月)的转录组高通量测序结果,发现合成类胡萝卜素关键前体番茄红素的合成酶基因(CrtQ)在皂荚荚果成熟早期被显著抑制,而负责内源激素脱落酸(ABA)的合成酶基因(AAO3)被显著诱导;另外,研究发现miR838-3p可调控类胡萝卜素途径中合成番茄红素的前体的酶基因(CrtB)。本研究结果表明,类胡萝卜素途径中色素合成过程被miR838-3p抑制进而诱导脱落酸的合成从而在皂荚荚果成熟中起着重要作用,并可能会反馈促进次生代谢物皂苷的生成。研究首次鉴定了皂荚荚果发育中类胡萝卜素合成途径基因的表达模式,并揭示了miRNA的调控,该结果可为提高皂荚抗逆性或遗传改良荚果内重要次生代谢物皂苷含量提供分子线索和依据。     

植物类胡萝卜素生物合成相关基因的表达调控及其在植物基因工程中的应用

类胡萝卜素是人类饮食结构中不可缺少的重要成分,具有多种重要的保健功能,尤其是有些类胡萝卜素,如β-胡萝卜素是合成维生素A的前体,具有抗癌和提高免疫力等功效。类胡萝卜素还广泛用于医药和化妆品工业。迄今为止,自然界中发现的大多数类胡萝卜素都是微量的中间产物,很难直接利用。本文概述了高等植物类胡萝卜素生物合成途径、类胡萝卜素生物合成关键酶基因的克隆,如异戊烯焦磷酸异构酶、牻牛儿牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶、!-番茄红素环化酶、ε-番茄红素环化酶,并对这些关键酶基因的功能进行鉴定。以水稻、油菜、马铃薯和番茄为例,阐明了类胡萝卜素合成关键酶基因在植物基因工程中的应用。将黄水仙的Psy和Lcy-b以及噬夏孢欧文氏菌(Eriwiniauredovora)CrtI基因同时转入水稻,水稻种子内胚乳类胡萝卜素含量得到提高。另外,在油菜、马铃薯和番茄中转入与类胡萝卜素合成相关的基因,类胡萝卜素含量也发生不同程度的提高,基因表达水平也发生变化。阐述了通过基因操作技术只能得到极少量的类胡萝卜素,只有进一步弄清类胡萝卜素代谢途径,提高外源基因在植物中的特异表达,才能合成大量类胡萝卜素,使类胡萝卜素遗传操作技术成功运用于作物品质改良。     

芒果八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)影响类胡萝卜素的合成,是合成途径中关键基因。为了研究芒果果实中PDS基因的功能,本试验采用RACE方法从‘贵妃’芒果果实中克隆得到了一个八氢番茄红素脱氢酶(PDS),该基因全长c DNA序列为1 820 bp,开放阅读框为1 650 bp,编码549个氨基酸,分子重量为61.34 kD,等电点为6.78。聚类分析发现芒果PDS蛋白与柚子、香瓜和番木瓜等植物的亲缘关系较近。其氨基酸组成主要是丙氨酸(ALa),白氨酸(Leu),缬氨酸(Val)等。利用定量PCR技术对不同品种中的PDS基因表达量分析,发现红色‘贵妃’品种表达量最高,而绿色‘桂七’品种表达量最低,对其蛋白的结构域、三级结构及互作蛋白进行了预测,发现其含有Phytoene-desat、PLNO2487 superfamily等结构域。利用STRING数据库对其互作蛋白进行分析发现其与PSY、ZDS、CRTISO等蛋白可能有相互作用。本研究为进一步研究芒果果实类胡萝卜素生物合成的分子调控机理提供理论依据。     

华北紫丁香黄烷酮3-羟化酶基因克隆及表达分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)作为黄酮类化合物合成早期的一个关键酶,在花色素合成途径中起重要作用。本研究依托华北紫丁香花序转录组高通量测序数据,结合RACE技术克隆出SoF3H基因,并对SoF3H基因进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR技术分析了该基因的组织表达模式。结果表明,SoF3H基因的c DNA序列全长为1 101 bp,编码366个氨基酸残基;该基因的g DNA序列无内含子;SoF3H基因的组织特异性表达分析表明该基因在花中表达量最大,且在花蕾期表达量最高。本研究将为深入研究华北紫丁香黄烷酮3-羟化酶(SoF3H)在花色素代谢途径中的表达特性提供参考依据。     

干旱胁迫下枇杷叶片的转录组分析

分析干旱胁迫下枇杷叶片的转录组,挖掘功能基因并对其差异表达基因进行筛选和分析,为枇杷抗旱提供理论依据。利用新一代高通量测序技术测序,对测序结果进行de novo拼接、功能注释和ORF预测,将差异表达基因在COG、GO和KEGG数据库中进行比对注释。测序结果表明,获得转录本共88 530个,平均长度为740.64 bp,ORF41 748条。COG、GO和KEGG数据库将转录本分别划分为24,54个功能类别及291条代谢通路中。25 197个差异表达的基因在30条代谢通路中显著富集,与酶活性、激素合成代谢和信号转导等相关的差异基因积极响应枇杷干旱,其中双萜类、油菜素类固醇和类胡萝卜素3条生物合成途径中的差异基因呈现出较为一致的表达。采用实时荧光定量(qRT-RCR)对选取的差异基因进行验证,其中过氧化物酶、蛋白激酶byr2、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、脱落酸8'-羟化酶、吲哚-3-乙酰乙酸合酶相关基因上调表达,细胞色素P450 734A1基因下调表达。为枇杷提供了较为全面的基因信息和代谢途径数据,为干旱胁迫下枇杷分子调控机制的深入研究奠定了基础。     

红光促进棉花胚性愈伤诱导的转录组分析

为探究红光促进棉花胚性愈伤组织形成的分子机理。本研究以陆地棉CCRI24为试验材料,利用RNA-seq技术对在红光、白光培养条件下的不同阶段棉花愈伤组织进行转录组测序,分析胚性愈伤形成过程的基因表达水平。对2个不同光处理愈伤组织共计8个样品进行转录组测序,共获得54.92 Gb clean data。与白光相比,5、15、20、30 d的非胚性愈伤组织中差异表达基因分别有261、58、139、44个上调,454、157、328、507个下调。GO功能富集分析表明,两种光质条件下的棉花愈伤组织差异表达基因的功能主要富集到细胞核、细胞膜等与细胞分裂有关的代谢过程。KEGG富集分析结果显示,红光与白光条件下的愈伤组织间差异表达基因主要参与光合作用-天线蛋白、玉米素合成、二萜类生物合成、类黄酮生物合成等代谢通路。研究结果表明,与胚性愈伤组织形成相关的8个基因的差异表达趋势与转录组测序分析结果一致。本研究为光质影响棉花胚性愈伤诱导的相关基因表达提供了数据,为解析棉花胚性愈伤组织诱导与形成的分子机制提供参考。     

黄独冻后培养愈伤ESTs序列和抗氧化酶的qPCR验证

为了对黄独冻后培养胚性愈伤组织正反向SSH-ESTs序列的测序分析及其抗氧化酶进行检测,本研究对其SSH-ESTs(A1~A4以及B1~B16)以及其抗氧化酶如过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶1(Cu Zn-SOD)和过氧化物歧化酶2(Mn-SOD)的差异表达进行q PCR验证。研究表明:与黄独胚性愈伤组织冻后光周期培养相比较,黄独冻后黑暗培养胚性愈伤组织中A-1、A-2、A-3和A-4的基因下调,表达量下降;而黄独冻后黑暗培养胚性愈伤组织中B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9、B-10、B-11、B-12、B-13、B-14、B-15和B-16的基因上调,表达量升高;同时,黄独冻后黑暗培养胚性愈伤组织的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶1(Cu Zn-SOD)和过氧化物歧化酶2(Mn-SOD)基因也上调,表达量也升高。本试验可为超低温保存后黑暗培养促进黄独胚性愈伤组织成活的机理提供分子依据。     

荔枝早期体细胞胚发生相关microRNA的鉴定与分析

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)种胚发育状态直接影响种子和果实大小及其品质,但迄今为止对其发育分子机理尚缺乏系统研究与了解。本研究利用‘御金球’荔枝幼叶诱导的胚性愈伤组织(EC)和早期体胚(SE)进行小RNA高通量测序。利用生物信息学方法鉴定体胚发生相关microRNA (miRNA),预测其靶基因,筛选潜在的miRNA-靶基因互作对;并利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法对差异miRNA与miRNA-靶基因的关系进行验证。在EC和SE小RNA文库中共鉴定得到属于564个家族的1 127个已知miRNAs。与EC相比,有88个miRNAs在SE中差异表达,包括51个上调和37个下调miRNAs。其中80个miRNAs预测得到581个靶基因,多为转录因子和参与初级、次生代谢途径的酶基因。根据基因表达模式共筛选得到167个具有负调控关系的miRNA-靶基因对,涉及胚胎发育、激素信号、氧化还原和细胞壁建成等生物学过程。RT-qPCR结果表明12个miRNAs的表达在胚性愈伤和体胚发生阶段变化显著,且4个miRNA-靶基因对具有负调控表达模式,这些结果与小RNA测...     

香蕉类胡萝卜素羟化酶基因MaLUT5克隆与分析

LUT5 (Lutein deficient 5)负责编码类胡萝卜素羟化酶CYP97A3,参与类胡萝卜素羟基化。为研究LUT5对香蕉果肉类胡萝卜素的调控,本试验以Pilose香蕉叶片为模板,根据NCBI预测的香蕉LUT5序列设计引物进行克隆,并对蛋白质结构进行分析。结果显示,克隆出的MaLUT5 CDS区全序列长为1 971 bp,编码656个氨基酸;MaLUT5蛋白为亲水性不稳定酸性蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,定位于叶绿体外膜。对Pilose香蕉各个组织进行RT-qPCR检测,结果显示MaLUT5基因具有很强的组织特异性,且在生殖器官的表达水平高于营养器官。此外,对转pBI121-Ma LUT5拟南芥进行GUS组织化学染色分析,结果显示MaLUT5能在拟南芥全株表达。经过完全黑暗处理后,LUT5在AAA基因型中的表达量显著提升,而在BBB基因型的表达量下降。在Pilose变黄的果实中瞬时超表达MaLUT5,MaLUT5表达量和总类胡萝卜素含量显著提高,编码ε-羟化酶CYP97C1的LUT1 (Lutein deficient 1)表达量变化不显著。综上,初步推断LUT5在A...     

基于转录组测序筛选黄牛低氧适应性相关差异基因

为探明藏黄牛对低氧适应的相关差异表达基因并分析差异表达基因功能和代谢通路,以藏黄牛和三江黄牛心脏组织为研究对象,提取总RNA,建立测序文库后利用Illumina HiSeqTM 4000进行测序,经生物信息学分析筛选出差异表达转录本,并对差异表达基因进行GO富集和KEGG通路分析,最后采用荧光定量PCR(RT-qPCR)验证测序数据的准确性。结果表明:藏黄牛相比于三江黄牛得到显著差异表达基因608个,其中上调基因467个,下调基因141个,推测表达量较高的B2M、COX7C、NFATC1、ECE1、CAST基因是与低氧适应性相关的基因;差异转录本GO功能富集分析可知,在分子功能、细胞组分、生物过程分别富集到327,253,2 191个条目,其中富集程度最高的条目分别是细胞发育过程、结合与转录因子活性、细胞前缘。KEGG分析结果表明,差异转录本显著富集在8条通路,筛选低氧适应性候选基因NFATC1是MP-PKG信号通路与T细胞受体信号通路成员,推测其通过cGMP-PKG通路与T细胞受体信号通路参与低氧适应性调控。采用高通量测序技术对藏黄牛和三江黄牛心脏组织进行转录组测序分析,获得大量差异表达基因,为研究动物低氧适应性机制奠定基础。     

低温胁迫对冰菜转录组水平响应分析

利用二代高通量测序技术对低温胁迫处理的冰菜进行测序,构建冰菜转录组数据库.分别得到24.13 Gb有效数据和24045条Unigene的注释,得到DEGs 1902个(T0 vs T1)和2134个(T0 vs T2).T0 vs T1组和T0 vs T2组分别有40和41个功能小类化归GO数据库;分别有20和24个功能分类注释到KOG数据库;155和272条基因注释到KEGG数据库,并分别富集在74和105条代谢通路.T0 vs T1组DEGs主要注释到植物信号转导等4个代谢通路;T0 vs T2组DEGs注释到苯丙醇类生物合成等11个代谢通路,其中正向影响代谢途径:丙酮醇类生物合成、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、脂肪酸代谢、类黄酮代谢、氨基酸的生物合成代谢途径等;负向影响代谢途径:植物-病原互作、植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢等途径.通过对淀粉和蔗糖代谢途径关键基因分析表明:低温胁迫1 h (T1),海藻糖6-磷酸合酶、海藻糖-6-磷酸酯酶、β-淀粉酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶、糖原磷酸化酶等5个关键基因表现为上调表达,未见下调表达基因;低温胁迫36 h (T2),海藻糖-6-磷酸合酶、己糖激酶、β-淀粉酶等3个关键基因上调表达,葡萄糖内酯-1,3-β-葡萄糖苷酶基因下调表达.选取淀粉和蔗糖代谢途径中8个DEGs,经RT-qPCR分析,8个DEGs的相对表达量与转录组表达水平相符.     

金花葵不同组织的转录组测序及分析

为了获得金花葵转录组信息,研究其功能基因的表达,本试验采用Illumina Hiseq 2500转录组高通量测序技术对金花葵不同组织的转录组进行测序,从差异表达基因中鉴定与黄酮类化合物合成的相关基因。研究结果表明,共获得97.64 Gb有效数据,各样品有效数据均为5.81 Gb,Q30碱基百分比在92.73%及以上。经过组装后共获得52 990条Unigene,其中39 651条被注释。通过KEGG分析,发现不同组织中黄酮类化合物生物合成的基因表达均有较大的变化。检测出单碱基重复至六碱基重复类型的SSR位点4 322个。本试验分析了金花葵各组织参与黄酮类化合物合成的相关基因,为进一步研究金花葵次生代谢产物合成的功能基因挖掘与利用提供充足的理论依据。     

西葫芦cDNA全长转录组序列分析

为解析西葫芦中类胡萝卜素积累的分子机制,本研究利用PacBio单分子长读长测序技术(single-molecule long-read sequencing technology, SMRT)对富含类胡萝卜素的黄皮西葫芦(21pu05)叶、雌花、雄花、未授粉果实和授粉10 d果实等组织的混合样品进行全长转录组测序分析。试验结果共获得循环一致序列(circular consensus read, CCS) 158 968条,其中全长非嵌合(full length reads non-chimeric, FLNC)序列113 284条。聚类分析获得高质量的一致序列28 383条,其中融合转录本有213个。进一步分析发现16 895个可变剪接基因位点,其中新基因位点1 734个,新转录本18 510个。序列结构预测鉴定出8 773个SSR位点、8 527个完整ORF序列,以及317个长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)。对16 508个新转录本进行了功能注释。以上研究结果为开展西葫芦类胡萝卜素合成相关基因的克隆及分子机制的解析提供参考。     

玉米雌穗发育杂种优势相关miRNA的研究

杂种优势已广泛应用于玉米育种, 在提高玉米产量、品质以及增强抗逆性等方面起到了重要的作用, 然而杂种优势的分子机制尚不清楚。植物miRNA主要在转录和转录后水平调节基因的表达。为阐明miRNA是否及如何对玉米雌穗发育杂种优势产生影响, 本研究对玉米杂交种郑单958及其亲本自交系(昌7-2和郑58)进行了高通量miRNA测序和降解组测序。取玉米雌穗花序分生组织(IM)发育为成对小穗分生组织(SPM), 进而产生小穗分生组织(SM), 及小花分生组织(FM)将3个不同时期的雌穗样品用于miRNA建库测序, 鉴定出16个miRNA家族中的81个保守miRNA为非加性表达, 认为是与雌穗发育杂种优势形成相关的miRNA; 3个阶段中分别检测到80.30%、56.06%和48.10%的非加性表达的miRNA被显性或超显性抑制。鉴定出8种新的miRNA, 属于7个miRNA家族。通过雌穗降解组测序, 发现在郑单958及其亲本自交系中共同检测到的miRNA靶向42个基因的82个转录本。根据测序结果构建了miRNA参与玉米雌穗杂种优势的模型, 并推测在雌穗发育早期阶段杂交种雌穗的miRNA的普遍抑制导致其靶基因上调表达, 随着发育进程miRNA逐步解除抑制, 带来其靶基因表达量的逐步减少, 这种miRNA与其靶基因的拮抗关系也许与玉米雌穗发育杂种优势形成有关。     

水稻苗期低温应答转录组分析

温度对水稻生长发育及产量建成很重要,为了进一步明确低温应答对水稻苗期生长发育的调节机制,以粳稻品种中花-11为试验材料,在17℃低温处理的条件下,利用新一代高通量测序手段-转录组测序(RNA-Seq)开展水稻苗期低温应答转录组分析。通过转录组分析,分别获得干净的高通量序列为46 384 074条和52 483 052条,鉴定并筛选出2 044个差异表达基因,其中,1 252个基因表达上调,792个基因表达下调; GO注释分析将全部的差异基因分为分子功能、生物学过程和细胞组分三大类,各自占比为63. 29%,8. 81%,27. 90%。利用KEGG数据库具体分析低温调节的2个通路光合作用通路和苯丙氨酸代谢通路中差异表达基因的数量及位置,并进一步预测了新基因的功能及与光合作用和苯丙氨酸代谢相关基因的互作蛋白基因。结果表明,低温胁迫对水稻的影响主要体现在生物学过程中,在光合作用、次生代谢的生物合成和苯丙氨酸代谢均有明显作用。另外,差异表达的WRKY转录因子为耐冷机制进一步研究提供方向与依据。     

大麦条纹叶片突变体的表型鉴定及转录组分析

叶色是与作物的光合速率及产量紧密相关的重要性状,利用叶色突变体研究叶绿体的发育过程及调控网络,有助于揭示叶色形成的机制。本研究在农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化过程中,获得一个具有条纹叶片的突变体(msal),该突变株具有条纹白化的叶片、茎秆,叶鞘、幼穗及幼种,其叶绿素和类胡萝卜素含量均下降。叶绿体超微结构观察显示条纹叶片突变体细胞的叶绿体数量变少,呈狭长型,结构不完整。转录组分析表明在突变体中有1004个差异基因,其中388个表达量下调,609个表达量上调。GO富集分析显示细胞组份"叶绿体"的富集频率最高,为23.0%,P值为5.74e^-07,表明"叶绿体"在转录水平上发生了改变。62个与叶绿体发育相关的差异基因在突变体中表达量均为上调,而与类胡萝卜素合成相关的差异基因表达量下调。我们推测该突变体抑制了类胡萝卜素的合成,影响了叶绿体发育,而作为补偿机制激活了叶绿体相关发育基因的表达。     

VIGS诱导PSY基因沉默对枇杷果实类胡萝卜素积累的影响

本研究从枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)果肉中克隆得到527 bp的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因保守片段,通过病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术干扰枇杷果实中PSY基因的表达,探究PSY基因在枇杷果实类胡萝卜素积累过程中的调控作用。结果表明,干扰枇杷PSY基因表达后,对照果实侵染部位着色为黄色,而沉默果实侵染部位着色为绿色,果肉中均能检测到TRV病毒分子,PSY基因表达量降低55.6%,总类胡萝卜素含量降低46.8%,说明PSY基因对枇杷果实类胡萝卜素积累起着正调控作用。     

基于转录组测序筛选鸡皮肤毛囊性状相关基因和关键通路

旨在通过对崇仁麻鸡背部皮肤毛囊组织的转录组学分析，筛选关键的差异表达基因和信号通路，探讨鸡皮肤毛囊性状的分子调控机制。采用TRIzol法提取皮肤毛囊组织总RNA,通过Illumina平台进行转录组高通量测序(RNA-Seq)。最后采用实时荧光定量的方法对转录组测序进行验证。研究结果如下：共筛选出了3 856个差异表达基因，在公鸡(BGB vs YGB)比较组合中筛选出了971个差异表达基因，其中274个表达上调，697个表达下调。在母鸡(BMB vs YMB)比较组合中筛选出了3 529个差异表达基因，其中1 477个上调，2 052个下调。在公鸡、母鸡共同的差异表达基因中筛选出了3个与皮肤毛囊性状有关的高表达基因KRT75、KRT6A和KRT14。在GO功能显著富集中，BGB vs YGB比较组合富集到了516个GO term, BMB vs YMB比较组合富集到了1 020个GO term,基因主要集中参与细胞黏附等活动。显著富集了多条KEGG通路，在BGB vs YGB比较组合中富集了8条显著的KEGG通路，在BMB vs YMB比较组合中富集了20条显著的KEGG通路，筛选出了...     

干旱胁迫对三七生理指标的影响及转录组分析

为揭示干旱胁迫下三七的生理特性和基因转录组变化,通过干旱条件和正常浇水控制研究干旱对于三七的影响。实验设置自然干旱和正常浇水（对照）处理,分别测定三七叶片的叶绿素含量、可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性、CAT活性和MDA活性,并从三七叶片中提取RNA进行转录组测序分析。结果显示,干旱胁迫下三七MDA变化非常明显,与对照相比,植株受到干旱后的MDA活性升高了88.41%,相反CAT活性受干旱影响的效果不明显。转录组分析结果表明,与对照相比,干旱处理样品上调基因431个,下调基因151个,对差异基因进行GO注释和功能富集性分析,有160个上调基因和53个下调基因共213个差异基因注释到数据库中。KEGG分析结果表明,有122个DEGs在37个代谢通路上。ABA合成代谢的关键酶,9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶被显著富集,说明干旱条件下,三七可能通过ABA相关合成酶的增加调控干旱应答。