油菜油体钙蛋白基因BnClol的克隆和表达

应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术.从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1 kD油体钙蛋白(caleosin)的基因BnClol.其全长1 058 bp的BnClol mRNA(GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3'末端Poly(A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子.Northern杂交结果表明,油菜中BnClol在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达.半定量PCR结果显示,BnClol在油菜种子吸水膨胀后前2d的茎中明显表达.证明在油菜种子发育期间,BnClol对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的.具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关.推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基(GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1～16位氨基酸残基组成的a-螺旋和17-61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80-120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域.N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca2 的EF-手结构.中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结(proline-knot)模体,在92～114位氨基酸残基组成的a-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用.     

油菜油体钙蛋白基因BnClo1的克隆和表达

应用同源序列克隆法设计同源简并引物,结合RT-PCR和RACE-PCR技术从甘蓝型油菜中分离克隆了编码28.1 kD油体钙蛋白( caleosin)的基因BnClo1。其全长1 058 bp的BnClo1 mRNA( GenBank中序列号为AY966447)包含完整的开放阅读框和3＇末端Poly( A)尾巴结构,染色体DNA结构上含6个外显子和5个内含子。Northern杂交结果表明油菜中BnClo1在种子形成中期开始丰富表达,在种子形成后期,即种子开始脱水成熟时期,高量稳定地表达。半定量PCR结果显示BnClo1在油菜种子吸水膨胀后前2 d的茎中明显表达。证明在油菜种子发育期间,BnClo1对mRNA的转录表达是由胚胎发育来调控的,具有显著的时空特性,并与油体的形成和积累密切有关。推测的caleosin蛋白为245个氨基酸残基( GenBank中序列号为AAY40837)组成的两性蛋白质,主要含3个结构域即由N末端1~16位氨基酸残基组成的α-螺旋和17~61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的N-末端亲水性结构域;由80~120位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和C-末端亲水性结构域。N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结合Ca²⁺的EF-手结构。中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结( Proline-Knot)模体,在92~114位氨基酸残基组成的α-螺旋跨膜区域,推测在caleosin蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的作用。     

油用牡丹PsFAD6基因的克隆与表达分析

本研究以油用牡丹(Paeonia suffruticosa)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR的方法克隆得到油用牡丹ω-6脂肪酸脱氢酶(ω-6 FAD)基因cDNA全长,命名为PsFAD6(GenBank登录号:KY233120)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 819 bp,其中开放阅读框1 326 bp,编码441个氨基酸,3'端非编码区长271 bp,5'末端非编码区长192 bp;多序列比对表明,油用牡丹PsFAD6氨基酸序列含有3个保守结构域,系统发育分析显示油用牡丹与葡萄处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PsFAD6蛋白无信号肽,具有3个跨膜域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性分析表明,PsFAD6在油用牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,其中,在叶片中表达量最高,雄蕊次之,在雌蕊中表达量最低;不同发育时期种子中,80 d表达量最高,60 d次之,在20 d中表达量最低     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

葡萄VvMSA基因的克隆及表达特性分析

为了解VvMSA基因的功能,以抗性葡萄品种Vidal Blanc组培苗为试材,克隆得到VvMSA基因,对其序列进行了生物信息学分析,并利用实时定量PCR分析了其组织表达特性和多种非生物胁迫和信号应答表达特性。结果表明,VvMSA基因片段大小为450 bp,编码149个氨基酸序列。生物信息学分析结果显示,VvMSA蛋白分子量约为16.703 k Da,等电点为5.68,不稳定系数为41.71,推测为不稳定蛋白。VvMSA含有65个氨基酸组成的ABA/WDS保守结构域。在进化上属于单独一个分支,它和已报道过的番茄Le ASR1分别属于同一个祖先进化出的2个分支。实时荧光定量PCR分析显示,VvMSA在葡萄不同组织中均有表达,花中表达量最高。多种逆境胁迫因子如盐、干旱和低温等能诱导VvMSA不同程度的上调表达,盐胁迫3 h时诱导表达量最高。同时,VvMSA受逆境胁迫信号分子NO和H_2S不同程度诱导表达上调,而SA则抑制VvMSA表达。激素ABA、GA_3、IAA和ET均能不同程度诱导VvMSA表达上调,并且VvMSA盐处理下的表达模式与ABA诱导的类似。综合以上结果推断VvMSA可能通过调控ABA信号途径来调节葡萄对盐胁迫应答。     

油菜开花时间调控基因SVP的克隆与表达特性分析

应用同源克隆法和RT-PCR技术分别从异源四倍体油菜湘油15号和四川黄籽花序组织中克隆了Short vegetative phase(SV)基因的同源基因,分别命名为BnSVP-1、BnSVP-2、BnSVP-3、BnSVP-4、BnSVP-5和BjSVP-1、BjSVP-2、BjSVP-3,GenBank登录号分别为JQ906717、JQ906718、JQ906719、JQ906720、JQ316471和JQ906715、JQ906716、JQ316472.序列分析结果表明,这些SVP同源基因编码区长726 bp,编码241个氨基酸残基,具有典型的MIKC结构域,是一类MADS-box调控基因.表达结果分析表明,光周期和GA3处理会使SVP基因的表达模式发生改变,而春化处理后的表达模式与对照相似,其表达模式的改变会导致开花时间提早;在开花前,SVP基因在根、茎、叶组织中均有表达,花期,在花器官的雄蕊、雌蕊和萼片中均有表达,在花瓣中无表达;幼角果的角果皮中该基因的表达水平要高于幼嫩种子.     

大豆GmHKT6;2基因的克隆与表达特性分析

为探明大豆中HKT蛋白基因的耐盐作用机理,从耐盐大豆材料中克隆到GmHKT6;2基因完整的cDNA序列,GmHKT6;2基因的开放阅读框(ORF)全长1 644 bp,编码547个氨基酸。序列比对与进化树分析表明:GmHKT6;2是大豆中的一个新HKT蛋白基因;GmHKT6;2基因在大豆的根、茎及叶中均能表达,150 mmol/L NaCl处理后,该基因在大豆根、茎及叶中的表达被强烈诱导并高效表达。结构域分析结果表明:大豆GmHKT6;2基因拥有10个可能的跨膜结构域(TMD)和阳离子转运蛋白保守结构域,推测其是通过调节相关阳离子的转运来调控大豆的耐盐性。     

月季RhMYB61基因的克隆及表达特性分析

为了研究月季MYB类转录因子在月季花朵开放中的分子特征和表达特性,利用转录组测序获得的序列信息,结合RACE技术,从切花月季萨蔓莎中分离获得一个MYB类型的转录因子基因,命名为Rh MYB61(登录号KY921844)。该基因ORF区包含1 323 bp,编码441个aa,分子量为49.1 k Da,等电点为7.66,公式C2123H3280N620O688S18。系统进化树分析表明,Rh MYB61与桃树中的Pp MYB86和枇杷Ej MYB8聚为一类,属于R2R3-MYB类型转录因子,进一步的蛋白序列多重比较发现,Rh MYB61在N端具有保守的R2-MYB和R3-MYB区域,包含有7个保守的基序,在R3-MYB区域包含有核定位序列。利用实时定量PCR技术分析了Rh MYB61的时空表达模式,结果显示,随着开花级数的增加,Rh MYB61的表达特性呈逐渐增加的趋势,在开花级数5级时表达倍数最高;失水12 h处理提高了Rh MYB61的表达倍数;与对照相比较,乙烯处理6,12,24 h显著提高了Rh MYB61的表达特性,1-MCP则显著抑制了其表达。上述结果为月季Rh MYB61生物学功能的研究奠定了基础,同时也为今后月季的分子育种研究提供了理论参考。     

牡丹PsSPL3基因的克隆和表达特性分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)转录因子在植物多个生理过程中发挥重要的生理功能,为了研究其在牡丹花芽休眠进程中的作用机理,采用RACE方法,从牡丹花芽中克隆得到了一个SPL基因。该基因全长cDNA 1 057 bp,完整开放阅读框为549 bp,编码182个氨基酸,Blast分析表明,编码的氨基酸序列中具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守结构域。与拟南芥已知SPLs蛋白构建进化树结果表明,牡丹SPL蛋白与At SPL3聚为一支,该基因被命名为PsSPL3。生物软件预测PsSPL3蛋白分子量为20.349 4 kDa,理论等电点为9.62。同源性分析了牡丹PsSPL3与其他已知植物的SPL3,相似性为47.98%~69.46%,其中与白桦的SPL3蛋白相似性最高,为69.46%。实时定量PCR分析PsSPL3基因在初花期牡丹不同组织中和花芽休眠过程中的表达水平,结果表明,PsSPL3基因在不同组织中表达差异较大,其中在根中转录水平最高,在茎和花瓣中次之;PsSPL3基因在休眠进程中的转录水平呈先上升后下降趋势,其中低温处理14 d时,PsSPL3基因的表达量达到最高。低温7 d结合外源施加GA3的牡丹花芽中PsSPL3基因的表达量显著增加,推测PsSPL3基因的转录受GA3诱导来促进牡丹花芽内休眠解除的进程。     

枸杞LbMYB12基因的克隆及表达特性分析

类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物,枸杞黄酮以其强抗氧化作用以及对心脑血管疾病的抑制和改善功能而广为人知。MYB转录因子参与类黄酮代谢过程的调控。本研究采用RACE技术克隆了枸杞LbMYB12基因全长cDNA序列。生物信息学分析表明,LbMYB12基因的完整开放阅读框(ORF)长930 bp,具有MYB蛋白家族保守结构域,蛋白质相对分子量为35.56 kD,等电点为5.05,其二级结构主要为α-螺旋。荧光定量PCR分析表明,LbMYB12基因在枸杞整个植株中均有表达。其中,在根中的表达量最低,在青果中的表达量最高。LbMYB12基因在果实不同发育时期的表达分析表明,开花后早期表达量显著高于成熟期果实。本研究为进一步探讨枸杞LbMYB12转录因子在类黄酮代谢中的作用提供了研究基础。     

棉花GhCO基因的克隆与表达分析

以中棉所36均一化全长cDNA文库为基础,利用RT-PCR技术从棉花中克隆了一个新的CO蛋白基因,命名为GhCO(GenBank:HM006910)。GhCO cDNA的ORF全长为1017 bp,编码338个氨基酸,含有一个CCT域和两个BBOX域。序列比较分析结果表明,GhCO蛋白与蓖麻RcCO、芒果MiCO具有较高的同源性,是棉花CO蛋白家族中的新成员。QRT-PCR结果表明,GhCO在棉花的花、蕾、胚珠等均有表达,而且在蕾和花中优势表达。GhCO在花芽分化形态出现以前就已经高调表达,推测可能与棉花的花芽分化有关。AtCO已经证明在花发育过程中对开花时间起正向调节因子的作用,推测GhCO蛋白在花发育过程中可能起重要作用。因此,构建了pBIGhCO过量表达载体,为进一步研究GhCO的功能奠定了重要的基础。     

夜来香LIS基因的克隆与表达分析

为了研究夜来香生物钟和花香代谢机制,本研究以夜来香花瓣为材料,利用PCR技术,从中获得了夜来香LIS基因的全长cDNA,并命名为CnLIS。生物信息学分析结果表明:该cDNA序列全长为1 800 bp,编码560个氨基酸,其中ORF为1 683 bp,5'UTR为56 bp,3'UTR为61 bp;该序列编码的氨基酸序列与软枣猕猴桃、温州蜜柑LIS基因的同源性分别为55%、50%,属于类异戊二烯合成C1超级家族。实时荧光定量PCR分析结果表明,0~12 h CnLIS表达水平较低,16 h后表达量明显上调,20 h表达量达最大,随后表达量急剧下降,其表达量随花瓣开放与闭合呈节律性变化。推测CnLIS可能参与夜来香香气形成,调控花香形成过程,同时,该基因的表达可能受生物钟基因所调控。     

枇杷EjAO基因的克隆与表达分析

果实的成熟和衰老是个复杂的生物学过程,一般认为活性氧(ROS)在其中起着重要作用。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR相结合的方法,从白肉枇杷成熟期果实中成功克隆到一个编码抗坏血酸氧化酶(AO)的基因,命名为EjAO。该基因全长2 174 bp,包含了长度为1 605 bp的开放阅读框。该阅读框编码的氨基酸数目为534个,所形成的蛋白质预测分子量为59.39 kD。实时荧光定量PCR结果显示EjAO在根和果实中高丰度表达,并且在白肉枇杷成熟期果实中的表达量远远高于红肉枇杷。核苷酸多态性分析显示EjAO基因在红肉枇杷和白肉枇杷共有五处多态性位点,其中T719C和A730C均导致氨基酸发生改变,推测可能对EjAO的酶学活性产生影响。EjAO的克隆和多态性位点的鉴定为阐明枇杷果实成熟与衰老机制及枇杷遗传改良育种提供一定的理论依据。     

小麦TaHPPR基因的克隆与表达分析

为研究羟基苯丙酮酸还原酶(HPPR)在小麦逆境胁迫中的作用,本研究利用同源克隆法获得1个小麦HPPR基因,命名为TaHPPR,并对其组织表达特性和逆境胁迫表达特性进行了分析.以'太原806'、'小白麦'、'京冬8'及'京411'为供试材料,用荧光定量方法获得组织表达和逆境胁迫表达数据.序列分析表明:TaHPPR基因含有...     

棉花GhbHLH基因的克隆与表达分析

bHLH(basic helix-loop-helix,bHLH)家族基因在植物生长发育和非生物胁迫应答中发挥着重要的作用。本研究从前期构建的棉花cDNA文库中发掘得到一个新的GhbHLH基因,该基因开放阅读框全长600 bp,编码199个氨基酸,序列分析表明,该基因具有典型的helix-loop-helix结构域。荧光定量PCR表明,GhbHLH在棉花根、茎、叶和纤维中均有表达,并且能够受高盐、PEG、低温、ABA和Me JA等的诱导表达,亚细胞定位结果表明,GhbHLH在细胞核内表达。推测该基因可能作为调控因子在棉花非生物胁迫应答中发挥作用。     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

矮牵牛DFR-A基因的克隆与表达分析

通过分离矮牵牛DFR-A基因,研究其在不同部位的表达规律和酶活性变化,为花色素苷合成的结构基因分离及其他研究奠定基础。基于已公布的矮牵牛DFR序列,直接从矮牵牛花瓣中分离了DFRA基因序列,利用实时荧光定量PCR技术研究其在不同器官中的表达特性,同时测定了不同器官中的DFR酶活性。（1）矮牵牛DFR-A基因cDNA序列为1473 bp,该基因最大开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸。（2）DFR-A基因在矮牵牛各种器官中均有表达,但不同组织中表达量存在差异,在花药中的表达量最高,其次是初开和盛开花瓣中,各期花蕾中的表达量都较低,而在叶中表达量最低。（3）DFR酶在叶片及花药中几乎无活性。在初开花瓣中达到最高峰。（4）除花药以外的部位,DFR酶活性与DFR mRNA浓度存在线性相关性。矮牵牛DFR酶活性主要受转录调控,活性在初开花瓣中最高。     

棉花GhGGB基因的克隆与表达分析

蛋白异戊二烯化修饰与植物的抗旱性有关,GGB作为Ⅰ型香叶酰基转移酶的β亚基参与植物的抗逆途径。本研究以‘TM-1’棉花叶片的c DNA为模板,PCR克隆得到GhGGB基因,其开放阅读框为1 131 bp,编码377个氨基酸,为亲水性蛋白。此外,通过RT-qPCR技术检测和分析了GhGGB在不同棉花抗旱品种中根、茎、叶中的表达模式,以及GhGGB基因对不同胁迫处理的响应。结果表明GhGGB基因在不同抗旱性的棉花品种中无特异性表达;在相同培养条件下,GhGGB基因受不同胁迫处理后其表达量存在部分差异,其中对干旱处理尤为显著。随干旱胁迫时间的延长,GhGGB基因的表达量逐渐上升。本研究结果为解析棉花的抗逆分子机制提供了基础。     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

芒果GGPPS基因的克隆与表达分析

在植物中,异戊烯焦磷酸(GGPP)是赤霉素、胡萝卜素、叶绿素等异戊二烯类化合物的公共前体物质。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因(Min GGPPS1)。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPS的全长基因并且为最大的ORF,全长为1 100 bp。与芒果Min GPS2(AFJ52722.1)氨基酸序列同源性为92%。蛋白质序列分析表明该序列含有两个DDx_(2-4)D保守基元(FARM和SARM)基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析表明,Min GGPPS1属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基。表达分析表明:Min GGPPS1在叶片中表达量最高,茎部表达量最低,青果果皮和成熟果果皮中表达量相似,在成熟果肉中的表达量大约是青果果肉表达量的5倍,暗示Min GGPPS1具有调控果肉后熟的功能。