新疆野扁桃CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析

CBF基因主要功能是调控下游大量抗冷基因的表达。CBF基因是植物抗冷途径的枢纽,对增强植物的抗冷能力极为重要。本研究利用染色体步移法得到了新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche)CBF基因家族成员Als CBF翻译起始位点上游的启动子序列,长度为1 391 bp(Gen Bank登录号:KP662710)。对启动子序列进行生物信息学分析表明,该序列存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,并且含有多个与植物非生物胁迫有关的响应元件:ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和LTRE低温应答元件等。在烟草叶片中进行瞬时表达的结果表明,该启动子序列具备在逆境胁迫下诱导驱动报告GUS基因表达的功能。本研究可为揭示CBF基因在野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理,以及为增强野扁桃CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改良中的作用奠定一定的基础,同时对野扁桃的繁育和保护也有极为重要的意义。     

绵果荠CBF基因启动子克隆及诱导特性分析

CBF基因不仅是植物CBF抗冷途径的枢纽,而且可以提高植物的抗冷能力。而植物的抗冷能力的提高是由于CBF基因调控下游抗冷基因的表达来实现的。本研究根据前期已克隆得到的绵果荠Ll CBF基因(JQ687132)序列,利用TAIL-PCR方法从新疆早春短命植物绵果荠基因组DNA中分离得到Ll CBF基因编码区上游1 172 bp启动子序列;将该序列连入克隆载体并测序,通过生物信息学分析表明,该序列含TATAbox、CAAT-box等典型的真核生物核心启动子元件,同时具有等逆境响应相关元件。在烟草叶片中的瞬时表达分析,进一步表明,在低温、干旱及盐胁迫诱导下该启动子序列具有驱动GUS报告基因表达的特性。本研究对新疆早春短命植物种质资源的开发利用及丰富作物逆境基因工程诱导启动子资源具有重要的实践意义。     

石榴CBF基因家族的鉴定及响应冷胁迫的表达模式

冷胁迫是限制石榴生产的主要非生物胁迫之一。C-repeat binding factors (CBFs)是一种可被快速诱导的关键信号基因,在植物的低温应答中起着至关重要的作用。然而,CBF家族在石榴中尚未阐明,该家族在低温诱导条件下的表达模式尚不清楚。本研究在石榴基因组中鉴定了7个Pg CBF家族基因,并分析了它们的蛋白保守结构域、蛋白理化性质、基因结构、系统进化、启动子顺式作用元件以及低温诱导条件下的表达模式。结果表明,7个Pg CBF蛋白均具有AP2/ERF结构域;7个PgCBF基因分布在1号(5个)和4号(2个)染色体;系统进化分析发现,7个Pg CBF蛋白分为3个亚类;启动子顺式作用元件分析发现,石榴CBF可能参与激素响应、非生物胁迫响应过程。冷胁迫处理下,除PgCBF4外,其余6个PgCBF基因均被显著诱导,表明PgCBF基因参与响应冷胁迫生物学过程,本研究为后续深入开展石榴抗性分子设计育种研究提供一定理论基础。     

四个苹果MdCBF基因克隆与表达分析

为了筛选出苹果中的抗冻负调控基因,培育抗冻苹果新品种奠定基础,通过生物信息学的方法从苹果中克隆了4个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Md CBFL1~Md CBFL4。通过与其他植物CBF/DREB蛋白氨基酸序列的多重比对发现,这4个蛋白具有CBF蛋白典型的结构特点,即1个AP2结构域,2个特征序列,即核定位信号区PKRPAGRTKFRETRHP和DSAWR保守序列。从系统进化树中可以看出苹果Md CBFL1~Md CBFL4蛋白与At DREB1蛋白聚在A-1亚族,推测它与拟南芥A-1转录因子功能相似,Md CBFL1~Md CBFL4蛋白表达受干旱、盐碱、低温等逆境胁迫的诱导。采用半定量RT-PCR的方法检测分析苹果中Md CBFL1~Md CBFL4基因在高盐(200 mmol/L Na Cl)、干旱和低温处理下基因的表达情况,结果表明,Md CBFL1基因对低温、干旱、盐胁迫3种逆境胁迫均有一定程度的响应,Md CBFL2~Md CBFL4基因受低温与高盐的诱导。为进一步阐明苹果Md CBF基因在逆境应答中的功能、机制提供了有益线索。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

大豆抗逆基因GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析

GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰8号基因组中分离到大豆抗逆基因GmDREB3启动子片段, 长度1 648 bp。该片段富含A/T碱基, 还含有TATA-box、低温响应元件MYC及其他顺式元件MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和GUS荧光定量测定分析各区段调控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。     

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。     

桃PG基因启动子克隆及序列分析

为获得桃多聚半乳糖醛酸酶( PG)基因启动子并分析调控元件,以桃品种大久保基因组DNA为模板,采用染色体步移技术克隆了PG基因的部分序列及其5′侧翼区,并分析其调控元件组成。结果表明,克隆产物长986 bp,3′侧翼序列与 GenBank中的PG基因序列的5′端部分序列同源性为96%,登录号为FJ940722。在789~839 bp位置存在基础启动子序列,转录起始位点位于828 bp的碱基C,其可能性为0.98。除含有CAAT-Box、TATA-Box等基本启动子元件外,还存在众多参与光响应元件、干旱诱导MYB结合位点、水杨酸响应元件等应答激素和胁迫信号元件,表明PG基因的转录和表达可能受到激素、干旱、光照等外界环境的胁迫以及衰老的调控。     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

扁桃AcCBF2基因的克隆及其在逆境胁迫下的表达分析

本研究根据扁桃生物信息学数据库,采用PCR的方法从扁桃(Amygdalus communis L.)中克隆了一个CBF转录因子基因,命名AcCBF2,基因开放阅读框(open reading frame,ORF)为717 bp,编码238个氨基酸,预测其分子量26.59 kD,等电点为5.29。氨基酸多重序列比对显示,AcCBF2基因编码的氨基酸与其它植物冷胁迫相关的CBF氨基酸序列具有高度同源性,含有一个AP2功能结构域和2个特征基序;系统发育树分析显示,AcCBF2基因属于DREB家族中的A-1亚族,荧光定量显示,AcCBF2基因只对低温和干旱胁迫有响应,对盐胁迫和ABA(脱落酸)没有明显响应。在低温胁迫下,表达量上调;而在干旱胁迫下,表达量先上调后下调。初步预测AcCBF2基因可能对扁桃非生物胁迫有重要的调控作用。     

木薯MeTPS7基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖生物合成途径中的关键酶,提高TPS基因的表达可以增强植物在干旱、低温等非生物胁迫条件下的抗逆性。为了研究TPS基因在热带作物木薯抗逆中的功能,本研究通过RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了一个TPS基因,命名为Me TPS7。该基因含有一个2 562 bp的开放阅读框,编码853个氨基酸,含有TPS家族保守结构域,属于TPS第Ⅱ家族成员。系统进化树分析表明,Me TPS7与杞柳和杨树中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性分别达到90.2%和90.3%。启动子元件分析表明,Me TPS7含有干旱诱导(MBS)、低温和干旱响应(C-repeat/DRE)、热胁迫响应(HSE)、ABA响应(ABRE)、以及光响应(ACE,G-Box,BoxⅠ,Box 4)等元件。实时荧光定量PCR分析表明,Me TPS7在须根中表达最高,叶片和储藏根中表达最低,其表达量仅为须根的34%和38%。而且,Me TPS7基因的表达能被干旱、低温、遮荫和ABA处理显著诱导。这些结果表明Me TPS7可能在转录水平参与ABA介导的木薯干旱、低温和遮荫胁迫响应,可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用,利用这些基因改良作物抗逆性具有重要意义。本研究在白菜中分离到一个DREB类转录因子基因BpDREB1 (EF219470)。该基因序列全长647 bp,推测编码蛋白含213个氨基酸,相对分子量为23 kD,理论等电点为5.11,与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明,BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示,BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后,其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子基因具有家族成员基因结构的特征,在低温、干旱应答途径中起重要作用。     

大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和1 h时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因在大豆种子中的表达量相对较高,叶中的表达量为1时,种子中的表达量为8.70。根据大豆基因组序列,扩增KTI1基因ATG上游启动子序列1 831 bp;生物信息学预测分析表明启动子中存在多种常出现在逆境胁迫诱导型启动子中的顺式调控元件,推测大豆KTI1基因启动子可能是受低温、盐、干旱和ABA诱导的诱导型启动子。本研究为进一步研究和应用大豆KTI1基因及其启动子提供理论基础。     

番茄SlETR6基因的克隆及非生物胁迫下的表达分析

为解析番茄乙烯受体基因SlETR6在非生物胁迫过程中的功能。以番茄为材料,克隆了番茄SlETR6基因,利用MEGA 5. 0软件对SlETR6基因编码的蛋白进行了聚类分析,并利用实时荧光定量PCR分析了SlETR6基因在番茄根、叶、花、果实不同发育时期的组织表达情况及对其在高盐、高温(40℃)、低温(4℃)、干旱胁迫条件下的表达模式。结果表明,SlETR6基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)为2 265 bp,编码754个氨基酸,蛋白质分子质量为85. 05 ku,等电点为7. 28,与马铃薯St ETR-like蛋白的同源性最高;启动子分析显示,SlETR6基因含有热胁迫、干旱胁迫、低氧胁迫、光响应、乙烯、水杨酸及赤霉素应答等相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,SlETR6在番茄不同组织中均有表达,且在花和转色期果实中有显著高表达。高盐胁迫6 h后,SlETR6基因呈现上调表达,12 h后达到峰值,而后回复正常表达水平;高温胁迫后,SlETR6基因表达量有明显的上升趋势;干旱胁迫早期SlETR6基因应答强烈,在胁迫处理1 h后表达量达到峰值。因此,推测SlETR6基因可能在番茄适应高盐、高温、干旱等逆境胁迫过程中发挥重要作用,可能参与番茄生长发育过程中的逆境调控。为番茄抗逆研究提供了新的候选基因资源。     

马铃薯细胞壁蔗糖转化酶基因StCWIN1启动子克隆与表达及其在干旱胁迫下的作用分析

植物细胞壁蔗糖转化酶（cell wall invertase,CWIN）是源、库组织蔗糖代谢及胁迫应答的关键酶。本研究利用基因步移法克隆马铃薯StCWIN1启动子片段,应用PlantCARE在线软件对启动子区域的作用元件进行分析,将融合StCWIN1启动子与GUS报告基因的表达载体转化拟南芥野生型,并利用组织化学染色和GUS实时定量PCR技术探究启动子表达活性、组织表达特性和响应干旱胁迫的表达规律。结果表明,克隆获得StCWIN1基因上游1956 bp启动子序列,其中包含核心调控、植物激素、防御及胁迫、光响应等关键元件;StCWIN1启动子在根、柱头和果荚组织中的表达活性高于其他组织;转StCWIN1启动子拟南芥株系叶片中GUS表达量高于野生型,且干旱胁迫显著抑制了GUS相对表达量。本研究克隆得到具有活性的StCWIN1启动子,基于研究结果推测目的基因可能参与根、花和果实等器官发育,对干旱胁迫也发挥应答调节作用。     

水稻DUF760基因家族的全基因组鉴定与表达谱分析

为了探索DUF760基因家族在水稻生长发育中的潜在功能,对水稻DUF760基因家族进行了全基因组鉴定、分类、启动子序列分析和表达谱分析。通过生物信息学技术在水稻和拟南芥中分别鉴定了6,8个DUF760家族成员。系统进化树分析将这些家族成员分成2个亚家族,二者在蛋白保守基序和基因结构上也存在一些特征差别。水稻DUF760家族基因启动子区域存在多个响应逆境胁迫和植物激素的顺式作用元件,ABRE(脱落酸响应)元件存在于家族所有成员的启动子序列中,OsDUF760-1启动子区域拥有9个脱落酸(ABA)相关的响应元件。在ABA处理水稻后,OsDUF760-1的转录表达水平显著下调,而OsDUF760-3显著上调,二者在干旱胁迫处理水稻后的表达变化模式与ABA处理水稻后的表达变化模式一致,说明这2个基因可能通过ABA信号途径参与水稻干旱胁迫响应,并且扮演不同的角色。除对ABA和干旱胁迫处理具有较强响应外,水稻DUF760家族成员还对JA(茉莉素)、低温及稻瘟菌处理具有较强的响应表达变化。