小麦淀粉GBSSII基因的克隆、反义和RNAi载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶II基因(Granule bound starch syn-thase,GBSSII)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的GBSSII基因有高度的同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSII基因的反义表达载体pWM101GBSSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSII基因的RNAi载体pFGC5941GBSSIIsa,这些载体的构建为研究GBSSII基因的功能打下了很好的基础。     

小麦淀粉GBSSⅡ基因的克隆、反义和RNAi载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶Ⅱ基因(Granule bound starch synthase,GBSSⅡ)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank 登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank 上已报道的GBSSⅡ基因有高度的同源性.以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSⅡ基因的反义表达载体pWM101GBSSⅡA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSⅡ基因的RNAi载体pFGC5941GBSSⅡsa,这些载体的构建为研究GBSSⅡ基因的功能打下了很好的基础.     

芥菜型油菜FAE1基因序列特征及其与芥酸含量关系的初步分析

采用同源序列法对6个芥菜型油菜(Brassica juncea)品种(高芥酸、中芥酸、低芥酸)、2份白菜型油菜品种(高芥酸和低芥酸)和1份黑芥品种的FAE1基因进行克隆和测序表明,9个品种的FAE1基因编码区全长均为1522bp,不含内含子,均编码507个氨基酸残基。序列比较表明,芥菜型油菜中有两种FAE1基因序列(BjFAE1.1和BjFAE1.2),其亲缘种白菜型油菜和黑芥中各有一种FAE1基因序列(BrFAE1和BnFAE1),BjFAE1.1对应于白菜型油菜的BrFAE1,BjFAE1.2对应于黑芥的BnFAE1;BjFAE1.1和BjFAE1.2之间存在71bp处核苷酸变异和Hind III不同的酶切位点(第1415位和第1144位),蛋白质水平上存在15处氨基酸变异。比较不同芥酸含量品种的FAE1基因序列表明,BjFAE1.1基因存在2个SNP位点(第968位和第1265位),BjFAE1.2基因也有2个SNP位点(第49位和第237位),这4个SNP位点中有3个位点(第49位、第968位和第1265位)导致蛋白质水平上氨基酸的差异。其中BjFAE1.1基因第968位的碱基变化(C→T)引起的第323位氨基酸变化(Thr→Ile),能够解释芥菜型油菜和白菜型油菜高芥酸到低芥酸(中芥酸)的转变;第1265位的碱基变化(T→C)引起的第422位的氨基酸变化(Phe→Ser),能够部分解释芥菜型油菜的高芥酸到低芥酸(中芥酸)的转变,白菜型油菜的高芥酸和低芥酸品种在该位点的碱基没有变化。BjFAE1.2基因第49位的碱基变化(T→C)引起的第17位氨基酸的变化(Phe→Leu),可以解释芥菜型油菜的中芥酸变成高芥酸(低芥酸)。陕北黄芥低芥酸突变株1278-3的FAE1基因序列和国外低芥酸品种比较,只在第1265位出现变异。     

荧光素酶表达载体yy621的构建及鉴定

在载体yy449的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间增加BglⅡ限制性内切酶位点,构建yy621载体。用PCR的方法分别扩增CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因。引物设计要满足如下条件:CaMV 35S minimal启动子序列扩增片段的上游应包括Bam HⅠ、下游应包括BglⅡ限制性内切酶位点;LUC基因序列扩增片段的上游应包括BglⅡ、下游应包括XbaⅠ限制性内切酶位点。以上两个片段先用BglⅡ限制性内切酶消化后进行连接,得到CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间含BglⅡ限制性内切酶的识别位点的片段,然后再用Bam HⅠ和XbaⅠ限制性内切酶进行消化,插入到载体yy449的Bam HⅠ和XbaⅠ酶切位点之间,替换原有的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列。经菌落筛选、PCR鉴定和测序验证,阳性菌落中的CaMV 35S minimal启动子序列与LUC基因序列之间包含BglⅡ限制性内切酶的识别位点,载体yy621构建成功。本实验中构建的荧光素酶表达载体yy621,适于今后用抗性相关基因替换LUC基因,测定合成启动子对抗性相关基因的具体调控与赋予植物对不良环境的具体抗性表现,或者用全长启动子序列替换CaMV 35S minimal启动子序列(-46～+1),对进一步观察LUC基因的表达调控具有重要的意义。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnaM154过表达载体的构建与转化

编码含MATH结构域(Meprin and TRAF homology domain)的基因目前在油菜中研究较少。本研究以甘蓝型油菜‘湘油15’(XY15)种子发育35 d抑制差减(suppression subtractive hybridization, SSH)文库为基础,进一步筛选获得实际编码中有两个连续MATH结构域的功能未知基因,该基因全长DNA序列为1 800 bp,我们将其命名为BnaM154。将目的片段克隆后插入表达载体pFGC5941-Nap中,成功构建了pFGC5941-Nap::BnaM154过表达载体。利用农杆菌介导的甘蓝型油菜下胚轴遗传转化方法,成功获得8株稳定遗传的转基因苗,为进一步研究BnaM154基因在甘蓝型油菜中的功能提供了科学依据。     

小麦AGPase基因LSU Ⅱ的克隆及反义表达与RNAi干扰载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号的发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶-AGPase质体型大亚基(AGPase plastidial large subunit,LSU Ⅱ)cDNA一段特异保守序列,长度为535 bp(GenBank No.EF378944),与DQ409820(小麦)、U66876(大麦)、AK069296(水稻)和DQ406819(玉米)分别有98%,97%,88%,88%的同源性,表明克隆出了小麦LSU Ⅱ基因的部分cDNA序列.以pWM101质粒表达载体为基础,将LSU Ⅱ反向置于pWM101质粒的CaMV35S启动子之后,构建了LSU Ⅱ的反义表达载体pWM101LSU ⅡA;另外,用pFGC5941干扰载体构建了LSU Ⅱ基因的RNAi载体pFGC5941 LSU ⅡSA,这些载体的构建为研究LSU Ⅱ基因的功能打下了基础.     

甘蓝型油菜依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段克隆及hpRNAi载体构建

依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的关键酶。本研究首先构建带有种子特异性napin启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-nap及带有组成型35S启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-35S;然后用PCR法从甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)中油119总基因组中扩增出依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段,再以扩增出的PFK基因片段作模板设计引物扩增出一个相应的小片段。将两个PFK基因片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰(RNAi)提高含油量的基因工程研究奠定了基础。     

白菜型油菜PABP5基因启动子的克隆及表达特性分析

本研究中利用基因组步移法从白菜型油菜中克隆到Poly(A)结合蛋白基因PABP5起始密码子上游长588 bp的一段序列,经软件分析预测表明,该序列具有典型的启动子结构,并且具有多个与花药特异性表达相关的顺式作用元件,如TATA box,CAAT box,AGAAA motif,AGGTCA motif,AAACCCTAA motif,GTGA motif等.为了研究该片段的表达特性,本文将克隆到的序列置换pPBI121中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS基因,构建了植物表达载体,转化拟南芥,获得了转基因植株.组织化学染色表明,在PABP5启动子Ppabp5的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的根尖、第一片真叶叶原基以及花药中特异表达.本研究为PABP5基因的进一步功能研究奠定了基础.     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

甘蓝型油菜MYB4基因RNA干扰载体构建

拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYB4(AtMYB4)编码负调控转录因子,通过对苯丙烷途径中关键酶C4H(肉桂酸4-羟化酶)基因的抑制来调控重要次生代谢物质芥子酸酯的生物合成,在防御紫外线中起重要作用。同为十字花科的芸薹属(Brassica)有多种重要的油料、蔬菜和园林作物,如甘蓝型油菜(B.napus)、白菜(B.rapa)、甘蓝(B.oleracea)和芥菜(B.juncea)等。本研究克隆了甘蓝型油菜MYB4基因家族的RNA干扰片段BMYB4I,将其反义片段、正义片段采用NcoI+AatII和BamHI+XbaI分别插入到改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成重组载体pF-GC5941M-BMYB4I(简称为pBMYB4I)。经复合PCR鉴定表明,载体构建成功,并转化根癌农杆菌获得工程菌株。为揭示芸薹属MYB4基因调控芥子酸酯等苯丙烷物质合成的分子机理以及探索抗紫外线分子育种奠定了基础。     

工业用高油高芥酸转基因油菜株系的获得

芥酸在工业上具有诸多用途,目前主要从菜籽油中制取,提高芥酸含量和含油量是工业专用高芥酸油菜育种的两个重要目标。本研究在甘蓝型油菜高油品种CY2中籽粒特异正向表达拟南芥At FAE1基因,增强脂肪酸延伸酶的活性,获得了两个高油高芥酸转基因株系,其芥酸含量由CY2的43%提高到了60%左右,含油量超过了50%,稍高于CY2。这一研究表明,极长链脂肪酸生物合成关键酶基因FAE1表达的上调不仅能显著促进芥酸合成,而且对提高含油量也有一定作用。田间观察和考种结果显示,两个株系的主要农艺性状与CY2相仿,未发生显著变化。该转基因油菜的产业化开发将有助于降低企业的原材料和芥酸产品的生产成本。     

大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

以吉豆2号基因组为模板,通过TAIL PCR方法,扩增得到大豆硬脂酸-ACP脱饱和酶基因启动子片段SACPD-Cp。PLACE在线启动子预测分析表明, 该序列中含有多种典型的种子特异性表达序列元件。将SACPD-Cp片段取代pCAMBIA1301质粒中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SACPD-Cp,通过农杆菌介导法在大豆组织中进行瞬时表达,GUS组织化学染色和荧光定量研究其表达特性。结果表明, SACPD-Cp驱动GUS基因在种子中的表达活性是CaMV35S启动子的93.01%;SACPD-Cp启动子与现已知启动子无同源性,仅在大豆种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶组织中均未检测到GUS活性,证实 SACPD-Cp是一个新的种子特异性启动子。     

Ta6-SFT在烟草中的逆境诱导型表达及抗旱性

分别构建CaMV35S启动子驱动的Ta6-SFT组成型植物表达载体和rd29A启动子驱动的逆境诱导型表达载体。利用农杆菌介导法分别导入烟草中,获得转基因株系,Southern杂交和Northern点杂交确定Ta6-SFT整合进转基因株系基因组中,并正常转录。以非转基因株系作对照,对2种转基因烟草株系进行干旱胁迫处理,采用半定量RT-PCR分析Ta6-SFT在转基因株系中的表达,同时测定胁迫0 d和18 d果聚糖含量及部分农艺性状。结果表明,含有rd29A启动子的逆境诱导型株系中Ta6-SFT相对表达量比在含CaMV35S启动子的组成型株系中高,而且积累更多的果聚糖;从株高、1/2株高处茎粗、叶面积数据来看,逆境诱导型转基因株系的生长势优于组成型株系,对干旱表现强的耐性。因此,在转基因植物中逆境诱导型表达Ta6-SFT基因将发挥更好的抗逆功能。     

南瓜韧皮部特异性启动子在转基因棉花中的表达

以自行构建的重组南瓜韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBII2.利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化棉花(Gossypium hirsutum L.)品种珂字312,共获得转pBII2和对照pBI121的抗卡那霉素棉花再生植株243株,筛选出172株为转基因阳性植株.Southern blot分析确证外源Gus基因插入拷贝数在1个或2个以上.对这些转基因棉花植株进行Gus染色结果表明dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动Gus基因的表达,前者仅在棉花的韧皮部内特异表达,而CaMV35S启动子驱动的Gus基因为组成性表达.Gus酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动Gus基因表达水平相当,但是转pBII2棉花植株的Gus富集在韧皮部组织.证明了dENP启动子驱动的外源基因在棉花中具有韧皮部特异而高效表达的特征,从而可用于棉花抗病、抗蚜虫转基因研究.     

RNAi介导的百合抗CMV和LMoV的载体构建

为获得高效的RNAi(RNA interference)表达载体,培育百合抗病毒新种质,选取感病百合叶片为试验材料,同源序列比对后选取CMV 2b基因271 bp和LMoV cp基因428 bp作为靶基因片段。首先采用RT-PCR方法对感病植株进行病毒检测,确定其带有CMV和LMoV病毒;之后提取感病植株叶片总RNA,反转录得到cDNA,设计带有不同酶切位点的引物,以反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增获得目的片段,产物回收纯化后,转化大肠杆菌,重组克隆。将各自的反向片段、正向片段顺次连接到载体pFGC5941上,经多次双酶切、连接、转化后,采用冻融法将构建好的载体转入农杆菌EHA105并进行重组鉴定。酶切结果表明已成功构建了分别抗CMV、LMoV的RNAi植物表达载体pFGC5941-C2和pFGC5941-L2,PCR扩增结果表明表达载体已成功转入农杆菌中。所构建的载体及获得的工程菌与预期的完全一致,获得含载体的农杆菌可以直接应用于百合转基因抗病毒育种工程中。     

棉花纤维特异表达GhCesA4启动子的克隆及序列分析

 以新疆陆地棉品种新陆早19的DNA为模板,克隆了棉花纤维特异启动子GhCesA4,GenBank登录号：EU183119 ,将启动子基因序列克隆到pMD19-T载体中,由载体通用引物M13-47、RV-M 经PCR鉴定获得pMD19-T/GhCesA4重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由1503 bp核苷酸组成,与GenBank中GhCesA4基因启动子序列同源性高达98％。分别用限制性内切酶ClaⅠ和BamⅠ双酶切重组质pMD19-T/GhCesA4和双元植物表达载体pBI121,分别回收pMD19-T/GhCesA4重组质粒中的GhCesA4小片段和pBI121 植物表达载体中缺失CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化、酶切及测序鉴定,获得由GhCesA4驱动报告基因GUS的新型植物表达载体,命名为pBI-GhCesA4     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。     

拟南芥中花特异表达启动子PCHS的分离及其功能初探

根据已发表的拟南芥启动子序列（AF248988）设计合成一对引物,以拟南芥（Arabidopsis）基因组DNA为模板,通过PCR技术获得了约含500 bp大小的DNA片段,经纯化后测序得到531 bp的目的片段。通过DNAman进行序列分析表明,与文献报道的PCHS启动子序列有99％的同源,含有四个花特异表达的调控元件。将此启动子替换pBI121上的CaMV35S启动子构建植物表达载体,农杆菌介导法浸染矮牵牛花、茎、叶、根。GUS瞬时表达结果表明,在花上出现较深的蓝色,而在茎上的蓝色很浅,在根和叶中不显蓝色,初步确定该启动子具有较强的花特异表达特性。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。