DNA分子标记技术的研究与应用

DNA分子标记是继传统的形态学标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的以DNA为基础的遗传标记技术,因其独有的技术特点,迅速在各领域得到广泛的应用与发展。本研究总结概括了基于m RNA的表达序列标签(ESTs)、差异显示逆转录PCR (DDRT-PCR)、特征性差异分析(RDA)、基因表达系列分析(SAGE);基于目的基因的保守DNA衍生多态性(CDDP)、目标起始密码子多态性(SCoT)、保守区域扩增多态性(Co-RAP)和基于反转录转座子的反转录转座子位点间扩增多态性(IRAP)、反转录转座子-微卫星扩增多态性(REMAP)等几种新型DNA分子标记技术的原理、特点、优缺点,以及常见DNA分子标记技术的特点比较及其应用,以期在其基础上推动分子标记技术进一步融合、创新与发展。     

iPBS分子标记研究进展

DNA分子标记是一种可以直接反映生物个体DNA水平差异的优良技术,自开发以来,在基因组作图和基因定位研究、基于图谱克隆基因、物种亲缘关系和系统分类中的应用等各个领域应用广泛。近年来,随着分子技术在应用过程中的不断完善、更新和发展,不同类型的DNA分子标记层出不穷。本综述基于反转录转座子的新型分子标记i PBS技术,介绍了iPBS分子标记的开发和基本的PCR反应体系,以及其在种质资源鉴定、遗传多样性研究、DNA指纹图谱构建、植物LTR类反转录转座子的序列分离等方面的应用和最新研究进展,以期为植物分子生物学研究及植物育种和改良提供参考。     

小麦幼苗活性LTR反转录转座子筛选及其对非生物胁迫的响应

LTR (长末端重复, long terminal repeat)反转录转座子占小麦基因组的60%以上,筛选小麦基因组中具有转座活性的LTR反转录转座子,并分析其在非生物胁迫下的响应,对研究反转录转座子在小麦抗逆境胁迫中的作用具有重要意义。本研究通过生物信息学分析,从转座子数据库(TREP database)中筛选出4个具有完整结构的LTR反转录转座子Fatima、Wis、Angela和Babara;同时利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、甲基化特异PCR (methylmion specific PCR, MSP)和转座子展示(transposon display, TD)技术分别分析了它们在盐、ABA、H₂O₂和干旱等处理的小麦幼苗期(二叶一心)叶和根中的表达水平、甲基化水平和转座活性变化。结果表明,这4个反转录转座子在正常条件下均存在基础水平的转录,并且能够响应上述4种胁迫而发生转录水平的变化,且在相同胁迫条件下表达水平变化趋势一致。Fatima、Angela和Babara在非生物胁迫处理下表达水平的提高与其甲基化水平的降低有关...     

花生DNA的五种改良CTAB提取方法的比较分析及其应用

花生是世界上重要的油料作物和经济作物之一,也是最重要的植物食用油来源之一,但花生分子标记和功能基因组学等分子生物学研究较落后。因此,本研究旨在建立适合自身的花生基因组DNA的提取方法,为开展花生分子标记研究和分子生物学研究提供帮助。本研究使用了5种改良CTAB法提取花生基因组DNA,所得DNA的纯度和浓度分别通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,再利用8种分子标记技术的48条单引物和4对转座子保守区扩增引物对提取获得的花生基因组DNA的质量进行扩增验证和应用。结果表明:(1)综合花生基因组DNA的质量检测数据以及花生分子标记技术和转座子保守区的扩增验证结果来看,五种改良CTAB法的DNA提取效果表现依次为:方法一>方法五>方法四>方法三>方法二,其中方法一为最佳首选,方法五和方法四的提取效果也好,但是由于其有利用到强腐蚀性的平衡酚,不安全且不环保,所以不推荐;(2)在花生上建立了8种分子标记技术和4类转座子保守区的扩增体系;(3)克隆获得了花生4类转座子保守区序列。本研究为今后开展花生分子标记研究及转座子的克隆鉴定利用提供了帮助。     

目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记技术在花生属中的应用

花生属分子标记领域的研究远落后于其他物种,而栽培种花生因其遗传基础狭窄,用大多数分子标记技术都难以检测到丰富的分子标记,因此限制了花生属野生种在改良花生栽培种方面的利用以及建立花生分子标记辅助育种技术体系。本文分别对花生属4个区组的16份种质资源和8份花生栽培种资源采用与功能基因相关的SCoT分子标记技术研究了花生属种间和栽培种内遗传多样性和亲缘关系。23条SCoT引物在花生属试材基因组中的扩增位点共194个,其中多态性位点130个,多态性达67.01%,通过聚类分析研究了它们之间的亲缘关系;在栽培种内筛选出19条多态性引物,在8份试材基因组中扩增位点198个,其中多态性位点67个,多态性为33.84%,表明SCoT分子标记技术能在花生栽培种内检测出一定程度的DNA多态性。     

IRAP分子标记在茄子种质资源亲缘关系分析中的应用

参考马铃薯和烟草的反转录转座子LTRs保守区域设计引物,对34份茄子材料进行PCR扩增,得到了多态性丰富的指纹图谱。聚类分析将34份茄子材料分为三大类群,表明IRAP分子标记适合于茄子种质资源的亲缘关系分析。     

中国樱桃(Prunus pseudocerasus Lindl.)IRAP分子标记技术体系的建立

基于中国樱桃LTR类反转录转座子的反转录酶(RT)序列信息设计引物,并根据扩增谱带的数量、多态性和可重复性等指标筛选IRAP-PCR引物;采用5因素4水平L_(16)(4~5)的完全随机正交试验,对影响PCR体系的主要因子进行优化,建立了中国樱桃IRAP分子标记反应体系。结果表明,筛选出9条引物,可以扩增222个清晰位点,位点的平均多态性比率为90.09%。PCR的最佳反应体系为25 μL,含2.0 mmol·L~(-1)MgCl_2、1.0 U Taq酶、0.2 mmol·L~(-1)引物、20 ng模板DNA、0.3 mmol·L~(-1)dNTP,采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。     

40个珍珠豆型花生SSR指纹图谱的构建

以南方花生主产区主栽的40个珍珠豆型花生为材料,利用62对SSR标记引物进行分子标记带型分析,从中筛选出12对多态性好、带型清晰的SSR标记引物进行指纹图谱构建。12对SSR标记引物共获得88个多态性位点,平均PIC值为0.779,利用这88个多态性位点构建了40个品种的SSR指纹图谱。研究结果为这些花生品种的鉴定奠定了基础。     

SSR标记在中国花生研究中的应用

SSR标记是广泛分布于多种生物基因组中由2~6个核苷酸组成的多次重复的一段DNA序列。根据近几年来SSR标记在中国花生上的研究进行了综述,包括SSR标记在花生种质遗传多样性研究、分子标记辅助选择育种等领域的广泛应用情况。通过对花生SSR标记相关研究的分析得知,中国花生育成品种普遍存在遗传基础狭窄的问题,认为在未来研究过程中应设计和开发大量多态性好的SSR分子标记,将标记研究工作与实际育种相结合,从而有效指导育种,提高育种效率。     

常用DNA标记的评述及在花生上的应用

简要介绍了5种传统的、最常用的DNA分子标记(RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SNP)的技术原理及它们的优缺点,也总结了TRAP这种新产生的分子标记的技术原理、优点及应用前景.综述了这几类分子标记在花生种质进化、遗传多样性分析、分子图谱构建及抗虫、抗病等方面的研究.利用SSR和RAPD标记能够发现野生种和栽培种多态性进而实现分子标记对花生的遗传多样性分析,可以将许多花生品种分为不同的品种群,能够对花生进行种质进化研究.RFLP和AFLP技术利于花生图谱构建,利用DNA中特定的限制性酶切位点上碱基对的改变及酶切位点之间的分子重排,可以发现花生品种间的DNA许多多态性位点,进而绘制分子标记图谱.AFLP技术在花生青枯菌和花生抗黄曲霉的研究方面有很大进展.RAID技术在花生根瘤菌、花生线虫病等方面已有显著进展.最后对分子标记在花生育种中的应用前景进行了简单展望.     

基于茶树Ty3-gypsy逆转录转座子序列的IRAP分子标记开发及利用

IRAP分子标记被广泛运用于植物物种间的鉴定及遗传多样性研究。为探究IRAP分子标记在茶树种质资源研究中的可行性,本研究采用通用引物成功扩增茶树Ty3-gypsy类型逆转录转座子逆转录酶序列,通过多态性及单倍型分析,评价其适于开发分子标记。基于相对保守区域设计并筛选的3对引物,采集自云南12个地区的65个不同类型的茶树种质资源材料通过PCR扩增获得带型稳定、多态性好、条带清晰的IRAP-PCR指纹图谱,其中筛选的26个IRAP标记在供试样本中具有100%多态性,可以有效区分茶树种质资源的采集地,也可对不同茶树类型的鉴定提供参考。本研究基于Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列开发的IRAP分子标记可为茶树物种关系研究提供新的思路。     

香菇反转录转座子间扩增多态性（IRAP）PCR反应体系的研究

摘 要：为了开发香菇反转录转座子间扩增多态性标记(IRAP),建立稳定的IRAP-PCR反应体系,本文对影响IRAP-PCR的主要因素进行了优化筛选。确定了最佳反应体系为：20μl反应体系中,包含30 ng模板DNA,0.30μmol/L引物, 0.3mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L Mg2+及0.75UTaq酶。梯度PCR试验筛选得到的最佳退火温度为56.1℃。采用上述最佳反应体系和引物LTR1L-MarY1L对香菇18个菌株进行了IRAP-PCR扩增,验证了该体系的可靠性。     

利用近红外技术和转座子标记鉴定花生杂交F_1真杂种

为探讨花生耐低温的遗传机理,实现耐低温分子标记辅助选择育种的长远目标,并培育耐低温的高油酸品种,搭配了2个普通油酸×高油酸杂交组合。首先通过近红外技术初筛,选择油酸含量预测值高于40%的F1单粒种子,进一步经转座子标记鉴定,分别获得了32粒和24粒真杂种。两对转座子标记引物Ah TE0398和Ah TE0167鉴定结果完全一致,也与FAD2等位基因特异PCR(AS-PCR)结果一致,证实了转座子标记鉴定技术的可靠性。     

花生栽培种SSR遗传图谱的构建

花生栽培种品种间分子多态性相对缺乏, 至今未构建出较完整的分子遗传图谱。本研究以粤油13和阜95-5为亲本, 通过杂交构建包含184个F6重组自交系的遗传作图群体。采用652对genomic-SSR引物和392对EST-SSR引物对亲本进行多态性检测, 从中筛选出121对多态性引物, 在亲本中共检测到123个多态性位点。利用作图群体对多态性SSR位点进行遗传连锁分析, 获得包含108个SSR标记(102个genomic-SSR标记和6个EST-SSR标记), 涉及20个连锁群, 总长568 cM, 平均图距为6.45 cM的花生栽培种遗传图谱。与前人构建的花生野生种(A. duranensis × A. stenosperma, AA genome)SSR遗传图谱比较, 初步确定本研究构建的遗传图谱中有11个连锁群与野生种遗传图谱的6个连锁群存在同源关系。     

花生InDel标记开发及其在含油量QTL定位中的应用

培育高含油量品种是花生重要的育种目标,开发稳定高效的分子标记对于标记辅助选择花生高含油量品种具有重要价值。本研究针对2个含油量差异显著的亲本徐花13 (高含油量)和中花6号(低含油量),利用PacBio三代测序技术检测基因组结构变异,分别从徐花13和中花6号中检测到35,794个和74,703个结构变异。根据双亲结构变异信息,针对前期定位的含油量区间开发InDel (插入/缺失)标记84个,其中9个InDel标记的扩增片段证实在双亲间具有多态性。基于RIL (重组自交系)群体中的杂合残余获得的NIL (近等基因系)构建的一个包含1160个单株的F2群体,使用9个多态性InDel标记鉴定其基因型,构建了总长度为149.84 cM的局部遗传连锁图谱。结合F2群体的含油量表型数据,将该含油量QTL定位在标记M23至M11之间,位于A08染色体1.2 Mb区段内。本试验证实了InDel标记开展花生含油量QTL定位的可行性,其定位的含油量位点及其紧密连锁的InDel标记能够为花生分子标记辅助育种提供理论和技术指导。     

应用IMP标记分析30份烟草品种的遗传关系

MITE (miniature inverted repeat transposable element)是植物中存在的高重复的一类转座元件。基于邻近MITE扩增多态设计的分子标记称为IMP标记(inter MITE polymorphisms)。从133个IMP引物中筛选出32个稳定多态的引物, 并以30个烟草品种为材料, 获得185个多态条带, 平均每对引物检测多态条带5.78个。聚类分析显示, 参试品种间遗传距离的变化范围为0.02~0.81、平均为0.33。30份烟草品种可分为3类, 晒烟、香料烟、北方烤烟品种等属I类; 第II类主要是美国NC系列品种、Coker系列品种和云烟系列烤烟品种; 第III类为两个白肋烟品种。结果表明, IMP标记能够在烟草中扩增并获得品种间多态信息, 可用于品种间的遗传关系分析, 这为烟草的遗传研究及分子辅助育种奠定基础。同时, 聚类结果显示, 30个栽培烟草品种之间亲缘关系较近, 丰富烟草种质资源应是今后育种的方向之一。     

萝卜抽薹基因连锁的AFLP和SCAR分子标记鉴定

本文运用AFLP分子标记技术,结合BSA法,对萝卜抽薹基因相连锁的AFLP分子标记进行研究,获得两个与萝卜耐抽薹基因相连锁的AFLP标记,遗传距离分别为14.6 cM和9.1 cM.序列测定和Blast分析表明,标记ACG-CAG(123 bp)与拟南芥中锌指蛋白3(zinc finger protein 3,ZFP3)的cDNA同源性为89%,期望值为6e-23;标记ACT-CTG(175 bp)与拟南芥中的Copia类反转录转座子AtRE1基因的同源性为83%,期望值为4e-42.并将其中一个标记转化为简单易行的SCAR标记,遗传距离为7.5 cM.     

谷子种质遗传多样性研究进展

中国是谷子起源中心,具有丰富的种质资源。为了揭示谷子遗传多样性遗传背景、遗传结构、多态性水平及品种间的亲缘关系等,为种质资源的收集、保存、评价和开发利用提供依据,国内外学者对谷子开展了大量的遗传多样性研究,取得了丰富的研究成果。从形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记技术4个方面综述谷子种质资源遗传多样性研究进展,为谷子种质资源全面系统研究提供理论基础。     

基于简化基因组的甜叶菊分子标记开发

本研究旨在筛选和开发具有多态性的甜叶菊基因组分子标记。选取4个甜叶菊品种为材料,利用简化基因组测序技术(RAD-seq)开发SSR和SNP标记。开发并验证了149对多态性丰富、重复性好、特异性高的简单重复序列(SSR)和4组功能性的SNP标记,开发的多态性基因组分子标记中包含了甜叶菊糖苷合成途径关键基因的新标记StKASPSNP-7。验证了基于KASP技术开发甜叶菊功能SNP标记的可行性,为甜叶菊遗传图谱构建、分子鉴定奠定了基础。本研究开发的SSR和SNP标记可应用于甜叶菊的遗传图谱分析、品种真实性的高效快速鉴定以及高糖苷含量新品种的开发。     

SSR分子标记在花生种质资源鉴定方面的应用研究

花生(Arachis hypogaea L.)富含丰富的油脂和蛋白质,是主要的经济作物之一。尽管花生已在全世界范围内广泛种植,但是其种质资源的丰富程度并不明显,有待进一步提高。目前已有较多种的分子标记技术应用于种质资源鉴定,其中应用最广泛的是SSR分子标记技术,它可用于花生亲缘关系的鉴定、品种鉴定、真实性鉴定以及纯度鉴定等。本综述讲述了SSR分子标记在花生种质资源鉴定方面的研究进展与应用现状,阐明了其优缺点,并对其进行了综合评价,以期为后期全面开展花生种质资源的研究奠定基础。