胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因克隆与表达分析

为探讨胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因在花芽性别分化过程中的调控机理,本研究从胡桃楸转录组测序数据库中筛选出与激素调控相关DELLA基因的差异片段,通过PCR扩增技术获得DELLA基因CDS全长序列,命名为JmDELLA (GenBank登录号:400411)。并利用生物信息学软件对JmDELLA基因进行生物信息学分析,利用RT-PCR对胡桃楸不同器官组织进行表达分析。克隆获得JmDELLA基因的CDS序列全长为1 842 bp,编码613个氨基酸,将该基因编码的氨基酸序列比对和聚类分析,结果表明该基因与核桃(Juglans regia)、薄皮山核桃(Carya illinoinensis)、杨梅(Morella rubra)亲缘关系同源性可以达到80%以上。RT-PCR表达分析表明胡桃楸激素调控相关JmDELLA基因在雌、雄花芽中表达量最高,因此推测该基因参与了胡桃楸花芽性别分化的整个过程。该结果为深入解析胡桃楸雌雄异型异熟性别分化的分子调控机理提供理论依据。     

新疆野生核桃LFY3基因的克隆及序列分析

LFY基因是调控开花及花发育的关键基因,为从分子水平了解核桃的成花机理,本研究以具有二次雄花的新疆野生核桃为材料,通过RACE-PCR方法,克隆了LEAFY (LFY)同源基因的全长cDNA序列,并且该基因是拟南芥LEY3的同源基因,因此命名为JrLFY3。该基因cDNA全长1 185 bp,开放阅读框长1 158 bp,编码385个氨基酸,预测其相对分子量为44 035.7 Da。JrLFY3基因序列比对及系统进化分析表明,该基因与新疆早实核桃、山核桃LFY同源基因的同源性高达90%以上,与山核桃、板栗等木本植物的亲缘关系较近,推测它们具有相似的功能。实时荧光定量PCR结果表明,JrLFY3基因在新疆野生核桃不同组织中均有表达,在芽、雌花和雄花序中表达量较高,嫩叶中表达次之,茎中表达量最少,研究结果为进一步分析新疆野生核桃LFY3基因的功能及在成花过程中的作用机理提供理论依据。     

玉米类LFY基因的克隆及其在不同光周期条件下的表达

采用每天9 h和15 h两种光照条件对热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四进行处理。以玉米茎尖为材料，采用RT-PCR方法，分离到1个1 265 bp的全长cDNA克隆，序列比较表明其为拟南芥LFY基因的同源基因，命名为类LFY（基因登录号为DQ343237）。类LFY与同源基因zfl2、RFL、LFY和FLO的同源性依次为93%、84%、57%和57%。它的DNA序列和推论的蛋白质序列与zfl1同源性最高，其编码的蛋白质与zfl1相比在第28、29和160位分别少1个丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸，在188位置多1个甲硫氨酸。该基因在2个供试自交系茎尖中长日照条件下不同生长时期持续表达，短日照条件下生长早期和后期不表达，其功能有待进一步研究。     

陆地棉Dirigent-like基因(GhDIR)的克隆与分析

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.本研究以抑制差减杂交( SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR.该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70 ～...     

三色堇4,5-多巴雌二醇双加氧酶基因的克隆及生物信息学分析

本实验以三色堇(Viola wittrockiana)的花瓣为研究材料,提取其总RNA,通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术扩增4,5-多巴雌二醇双加氧酶(4,5-DOPA dioxygenase extradiol)基因的cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。本实验成功克隆VwDODA的cDNA全长1 055 bp,其中3'端非编码区157 bp,包含29 bp Poly(A),5'端非编码区103 bp,其开放阅读框为795 bp,编码263个氨基酸。通过NCBI的BLAST比对表明VwDODA编码的氨基酸序列与其他植物相关基因的相似性达到80.29%,与大豆(Glycine max)亲缘关系最近。通过生物信息学分析软件对VwDODA的蛋白质结构与功能进行预测,结果表明Vw D-%ODA是一种亲水稳定蛋白,不存在跨膜区域和信号肽,分子式为C1337H2026N356O384S7,等电点为6.70,分子量为29 455.37。本研究为将来三色堇中甜菜色素与花色素的互斥现象研究打下了基础。     

菠萝LEAFY基因克隆与表达模式研究

植物LEAFY(LFY)基因可以调控花分生组织和花器官的形成。根据菠萝基因组数据库信息,本研究从菠萝(Ananas comosus(Linn.)Merr.)顶芽中成功克隆了菠萝LFY基因c DNA全长序列。分析结果表明,Ac LFY编码366个氨基酸,含有5'-N端脯氨酸富集区、亮氨酸重复区以及碱性及酸性结构域,具有FLO/LEAFY家族的典型结构特征。利用实时荧光定量PCR技术分析了Ac LFY基因在菠萝自然成花和乙炔处理成花不同发育阶段的表达情况。结果显示,乙炔处理可以诱导Ac LFY基因表达,处理后40 d即菠萝花序形成时期表达量最高,随后逐渐下降;自然成花过程中,Ac LFY基因的表达在50 d时达到最高峰,此时为花原基发育、花序形成时期。Ac LFY基因在不组织器官中的表达存在明显差异,顶芽中表达量最高,根系中表达量最低。     

新疆巴州牦牛Lfcin基因的克隆与分子特征

利用PCR技术首次从新疆巴州牦牛基因组DNA中扩增获得了乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)基因exon 2编码区,其中含有乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因编码区序列;利用在线生物软件对Lfcin蛋白的结构进行预测.结果表明:克隆获得了含新疆巴州牦牛LF基因exon 2的DNA序列(GenBank:EU547256),共778 bp,其中LF基因exon 2编码区长165 bp,Lfcin基因编码区长75 bp;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;各物种的Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测的Lfcin 3D模型显示,Lfcin为一段由α-螺旋和β-折叠组成的"U型"结构.首次从新疆巴州牦牛品种中克隆获得Lfcin基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛Lfcin蛋白基因工程和蛋白质功能方面的研究奠定了重要基础.     

砂藓(Racomitrium canescens)RcRab基因的克隆及生物信息学分析

本研究以砂藓(Racomitrium canescens)为材料,从砂藓干旱处理转录组数据库中筛选获得小G结合蛋白基因Rab的mRNA序列,通过RT-PCR法扩增,得到RcRab基因的CDS序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该基因c DNA全长为1171 bp,包含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸。预测该基因有Rab家族的保守结构域-G结构域。RcRab蛋白分子质量为23.29 kD,理论等电点为5.76,具有亲水性,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。进化树分析表明,RcRab蛋白质与小立碗藓(Physcomitrella patens)Rab蛋白质亲缘关系最近。本研究可为进一步探索RcRab基因在苔藓植物中的抗旱机制提供数据基础。     

金柑开花关键基因FcFT1的克隆及表达分析

本研究以融安金柑为试材,采用同源克隆技术获得成花素基因Fc FT1全长序列,并对该基因的生物信息学和遗传进化关系进行了分析。利用q RT-PCR技术,分析了Fc FT1在花发育期间不同花器官、不同组织,以及日周期中Fc FT1在花、茎、叶的表达情况。结果表明:Fc FT1基因完整开放阅读框为531 bp,编码177个氨基酸。Fc FT1编码的蛋白具有单一而非常保守的PEBP结构域;蛋白质结构比较不稳定,为亲水蛋白。系统进化树表明Fc FT1与甜橙、温州蜜柑和枳壳中的FT同源基因亲缘关系最近。q RT-PCR结果显示,在花发育期,花药中Fc FT1表达量最高;日周期变化中,Fc FT1在花、茎、叶中的平均表达量差距不显著,表达较稳定。本研究结果为进一步揭示FT基因在金柑开花调控中的功能奠定了基础。     

水曲柳FmAG基因克隆及生物信息学分析

AGAMOUS(AG)基因是调节植物开花的基因。本研究根据水曲柳转录组数据筛选出与开花相关基因,通过RT-PCR方法扩增,得到水曲柳AG基因序列,命名为Fm AG,并利用生物信息学手段对获得的序列进行结构及功能预测,结果表明,水曲柳AG基因编码区全长726 bp;蛋白质分子量为27 913.51,具有典型的MADS-box结构域和K-结构域,是一个无信号肽、无跨膜区、亲水性、不稳定蛋白,二级结构由148个α-螺旋组成,系统进化树分析显示该蛋白与Fraxinus nigra、Fraxinus pennsylvanica的AG同源蛋白亲缘关系最近,进一步确定所获得的序列为AG基因。本研究为今后通过基因调控分子育种和促进水曲柳优树种源有性繁殖奠定基础。     

大豆吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)的电子克隆和进化分析

电子克隆(In silicocloning)是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陆号为DQ139265)。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,20~955 bp),编码311个氨基酸。通过与水稻、日本百脉根、烟草、截形苜蓿等物种的吡哆醇生物合成蛋白序列比对,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索、筛选、拼接,是克隆基因的有效途径。     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。     

小偃麦异附加系TaTGA4转录因子基因的克隆与生物信息学分析

本研究利用Genefishing技术,从经过白粉病菌E09诱导处理12 h的高抗白粉病菌小偃麦(小麦-中间偃麦草异附加系)种质SN6306的c DNA中获得上调表达差异片段,经克隆测序,获得一个375 bp的序列。在NCBI数据库和小麦全长数据库Tri FLDB中进行相似性比对,预测其为TGA4转录因子的一段序列。设计序列的特异引物,经PCR扩增,从SN6306中克隆到小麦Ta TGA4基因的c DNA全长序列,并对该基因及其所编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。结果表明,Ta TGA4基因序列的开放阅读框长度为1 221 bp,编码含406个氨基酸残基的蛋白。BLASTP相似性比对分析显示,Ta TGA4含有b_ZIP1超家族与DOG1超家族两个保守结构域,且该蛋白与小麦的近缘物种节节麦中的同源蛋白一致性达到92%,与乌拉尔图小麦中的同源蛋白一致性达到90%。从多序列联配及系统进化树分析中可以推断出Ta TGA4属于TGA4转录因子类。本研究可为Ta TGA4基因在小麦抗白粉病中的功能研究打下基础。     

马尾松FLO/LFY基因的克隆及其功能分析

FLO/LFY及其同源基因是控制花分生组织形成和开花时间的基因之一。本研究通过反转录PCR克隆技术和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从马尾松中分离得到了PmLFY和PmNLY两条FLO/LFY基因的cDNA序列。两条序列均包含完整的编码区与"5'端"和3'非翻译区,长度分别为1 555 bp和1 236 bp,对应的编码氨基酸长度是411 aa和310 aa。序列分析发现PmLFY和PmNLY两个蛋白均属FLO/LFY蛋白;分别有13和11个丝氨酸激酶位点。对PmLFY和PmNLY两个蛋白与其他物种的FLO/LFY蛋白构建进化树,发现PmLFY蛋白与辐射松最为接近,与加勒比松、挪威云杉等较为接近,属同一分支;PmNLY蛋白只存在于裸子植物之间,与辐射松,华山松等松科关系较近,但与PmLFY分化较明显;裸子植物之间LFY-like与NLY-like分化十分明显,裸子植物的NLY蛋白与被子植物的FLO/LFY更为接近。通过组织特异性分析发现,PmLFY和PmNLY主要集中在冬芽中表达,且在侧芽的表达量高于顶芽,分别相对于顶芽表达量的1.8和1.3倍。研究结果为进一步分析马尾松FLO/LFY的功能和开花作用机制奠定了基础。     

越南油茶环阿屯醇合酶基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆的方法克隆得到环阿屯醇合酶基因全长并命名为CvCAS,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvCAS全长2 411 bp,包括一个2 277 bp完整的开放阅读框,编码758个氨基酸,与茶(Camellia sinensis)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis var. chinensis),刺楸(Kalopanax septemlobus)和人参(Panax ginseng)的CAS蛋白序列相似度均在85%以上,系统发育树分析显示CvCAS与茶(Camellia sinensis)和向日葵(Helianthus annuus)的CAS蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为86.6 kD,理论等电点为6.20,无跨膜螺旋区,属于不稳定亲水性蛋白。序列比对分析表明,CvCAS具有氧化鲨烯环化酶(OSCs)超家族典型结构位点(DCTAE),三萜合成酶高度保守结构...     

斑茅铜锌超氧化物歧化酶基因(SaSOD-1)的克隆与序列分析

斑茅是甘蔗近缘野生种之一,具有较强的抗逆性,研究并开发利用斑茅的强抗逆基因,对甘蔗育种具有重要意义。本研究以高粱Cu/Zn-SOD(登录号:XM 002445626.1)cDNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行检索、比对、拼接,通过设计特异引物,PCR扩增和序列分析验证,克隆得到2个Cu/Zn-SOD(SaSOD-1a和SaSOD-1b,登录号:KJ001795和KJ001796)基因全序列,其中SaSOD-1a基因组序列全长2 473 bp,SaSOD-1b基因组序列全长2 228 bp,均有8个外显子,7个内含子,其cDNA序列长度均为692 bp,编码206个氨基酸。序列比较分析表明,SaSOD-1a和SaSOD-1b序列相似性为98.6%,有8个单核苷酸多态性位点,蛋白质相似性为99.0%,2个氨基酸变异位点。用推导出的氨基酸序列与其它植物做同源进化分析,与高粱、玉米、谷子等比较均表现出较高的保守性。研究结果可为进一步了解超氧化物歧化酶与斑茅耐旱性的关系奠定基础。     

芝麻八氢番茄红素脱氢酶基因SiPDS的克隆与序列分析

来自芝麻的八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturase gene,PDS)的分离鉴定尚未见报道。本研究根据已报道植物PDS基因的氨基酸保守区,设计简并引物,扩增出编码芝麻新蔡选抗PDS基因c DNA的中间片段。利用电子克隆技术,从芝麻EST数据库中比对得到一条高度同源的序列,并通过RT-PCR方法,从新蔡选抗成功克隆了八氢番茄红素脱氢酶基因的c DNA,命名为Si PDS(Gen Bank登录号:KJ191121)。c DNA序列全长2 273 bp,开放阅读框长度为1 743 bp,编码580个氨基酸。根据克隆获得的全长c DNA序列设计引物,从新蔡选抗DNA中克隆获得Si PDS基因的全长DNA,长度为5 592 bp,转录区包括14个外显子和13个内含子。序列分析表明,Si PDS与其他植物的PDS蛋白序列高度相似;系统进化树分析表明,芝麻Si PDS与黄芩的亲缘关系最近。Si PDS基因可以用作植物病毒诱导的基因沉默载体的内源检测基因,在利用基因工程技术改良芝麻农艺性状方面具有较大的应用价值。     

马尾松PmLFY和PmNLY基因的克隆与表达分析

本研究在前期马尾松转录组测序中获得两个LFY同源基因片段的基础上,克隆获得Pm LFY和Pm NLY基因全长,分别为1 164和1 212 bp,编码387和403个氨基酸。生物信息学分析表明,2个LFY同源基因都具有典型的FLO_LFY结构域,但Pm NLY基因缺失了XEL…XTL…XEL…拉链结构。同源性和进化分析表明,LFY和NLY基因分别单独分为一类,并且与针叶植物的亲缘关系非常近。表达分析表明,2个基因都为组成型表达,均主要参与了雌球花发育过程,并且Pm LFY还参与了球果发育。本研究为今后马尾松花发育机理研究提供理论依据。     

‘库尔勒香梨’自交不亲和S-RNase等位基因全长的克隆与分析

‘库尔勒香梨’是新疆重点发展的特色果树品种之一,具有自交不亲和性。本研究以新疆轮台国家果树资源圃栽培梨品种‘库尔勒香梨’为试材,利用梨S基因的保守序列设计合成的引物:‘FTQQYQ’/‘antiIIWPNV’初步确定‘库尔勒香梨’S-RNase等位基因型后,设计等位基因特异性引物,利用RT-PCR克隆两个花柱S-RNase等位基因cDNA片段,RACE(cDNA末端快速扩增)技术进行cDNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam等在线软件分析两个S-RNase等位基因的编码蛋白特性。根据NCBI上已登录的63条梨属S-RNase基因的全长序列,用DNAMAN软件对其氨基酸序列进行比对并用MEGA 4.0构建进化树。本试验从‘库尔勒香梨’中克隆得到了S_(22)-RNase(Gen Bank接受号:KX214125)/S_(28)-RNase(Gen Bank接受号:KX214124)等位基因cDNA的全长序列,为分子手段调控梨自交不亲和性状奠定了基础。S_(22)-RNase基因cDNA全长904 bp,ORF(开放阅读框)长684 bp,编码227个氨基酸;S_(28)-RNase基因cDNA全长921 bp,ORF长687 bp,编码228个氨基酸。BLASTP比对显示,这两个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为25.6 k D和25.9 k D,等电点9.36和9.30,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,‘库尔勒香梨’的S_(22)-RNase和S_(28)-RNase处在不同的两个分支上,表明两基因亲缘关系较远。     

小麦耐盐相关基因TaSTK的克隆

利用RACE方法,从小麦耐盐突变体RH8706-49中扩增获得小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Triticum aestivum serine-threonine protein kinase）基因TaSTK的全长cDNA序列,含1 958 bp,其中开放阅读框1 431 bp,编码476个氨基酸。其编码区基因组DNA全长为4 095 bp,含5个外显子。该基因的全长cDNA序列及基因组序列均已提交GenBank数据库（登录号：DQ103756和DQ341377）。经过NCBI比对发现该基因的氨基酸序列与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白激酶都具有较高的同源性。Northern杂交检测表明,TaSTK在小麦中属于盐诱导增强型基因,并且在耐盐材料RH8706-49中诱导增强程度高于敏盐材料H8706-34。TaSTK的杂交信号非常弱,表明TaSTK在小麦幼苗的叶片组织中属于低表达的基因类型。