家蚕糖转运蛋白BmST1基因的克隆与序列分析

糖转运蛋白运输葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等透过细胞膜为机体提供能量。根据GenBank已登陆的其它物种的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST1。基因编码区长1 392 bp (GenBank登录号：FJ373021),编码463个氨基酸,预测蛋白分子质量为51.635 kDa。序列分析显示基因有2个外显子,含有11个跨膜结构域。RT-PCR表明该基因仅在本文所检测的家蚕丝腺中表达。     

家蚕糖转运蛋曰BmST1基因的克隆与序列分析

糖转运蛋白运输葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等透过细胞膜为机体提供能量.根据GenBank已登陆的其他物种的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST1.基因编码区长1 392 bp(GenBank登录号:FJ373021),编码463个氨基酸,预测蛋白分子质量为51.635 kDa.序列分析显示基因有2个外显子,含有11个跨膜结构域.RT-PCR表明该基因仅在此文所检测的家蚕丝腺中表达.     

籼稻低亲和阳离子转运蛋白基因OsLCT2的克隆与生物信息学分析

OsLCT1是目前在水稻中唯一鉴定出来的参与韧皮部镉离子运输的关键转运蛋白,与水稻籽粒镉积累密切相关。本研究根据Gene Bank已发表的小麦Ta LCT1基因序列信息设计引物,利用RT-PCR方法从籼稻93-11和华占中克隆了低亲和阳离子转运蛋白基因(LCT),并命名为OsLCT2。生物信息学分析结果表明,该基因定位在5号染色体上,全长2 699 bp,包含3个外显子和2个内含子,其CDS全长1 437 bp,编码478个氨基酸,包含2个PEST序列和11个跨膜结构域。OsLCT2蛋白二级结构预测显示,α-螺旋占57.11%、β-折叠占7.74%,无规则卷曲占35.15%。序列比对和系统进化树分析结果表明,OsLCT2与小麦的亲缘关系最近达65%,其次为高粱64%,而与水稻OsLCT1的同源性并不高,推测OsLCT2的功能可能与Ta LCT1相类似。     

罗田栗实致腐真菌的分离鉴定及拮抗菌筛选

采用组织分离法,从无症和显症的罗田板栗栗实中分离致腐真菌,再利用形态学特征与真菌ITS rDNA序列分析相结合的方法鉴定分离真菌。结果表明,分离真菌经鉴定分属11个种：匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)、栗疫菌(Cryphonectria parasitica)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、扩展青霉(Penicillium expansum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus luteolus)、白假丝酵母(Candida albicans);其中栗疫菌(Cryphonectria parasitica)和扩展青霉(Penicillium expansum)的分离率最高。供筛的6株拮抗细菌的平板对峙实验表明：丁香假单孢杆菌和荧光假单胞杆菌对板栗致腐真菌有抑制作用,其中荧光假单孢杆菌对板栗主要致腐真菌ITS4和ITS6的抑制圈直径超过10mm。     

家蚕BmNaPi基因的克隆表达与酵母穿梭表达质粒的构建

磷酸盐是蚕必需的无机物,钠离子依赖性的磷酸盐转运蛋白(Na(+)-dependent phosphate cotransporter,NaPi)调节磷酸盐在生物体内的代谢和转运.本研究通过生物信息学分析和分子生物学试验获得了家蚕NaPi的同源基因BmNaPi,该基因位于家蚕8号染色体,编码区长1 437 bp,有10个...     

紫花苜蓿铝激活苹果酸转运蛋白基因的克隆与亚细胞定位

为揭示紫花苜蓿耐铝机理,根据已知的紫花苜蓿(Medicago sativa L)与铝胁迫相关的EST序列,运用RACE技术获得了紫花苜蓿铝激活苹果酸转运蛋白基因的全长cDNA,命名为MsALMT1,这一全长cDNA为1 638 bp,包含一个1 344 bp的最大开放阅读框,编码448个氨基酸,BLAST比对发现,Ms...     

马尾松RCA基因的克隆和序列分析

1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubis CO)活化酶(RCA)是体内活化光合作用限速酶—Rubis CO的重要酶。本研究通过反转录PCR和c DNA末端快速扩增技术,从马尾松中分离得到了Pmrca1(登录号KF420118)和Pmrca2(登录号KF420119)两条RCA基因c DNA序列。两条序列均包含完整的编码区与5'端和3'非翻译区,长度分别为1 816 bp和1 953 bp,编码Pm RCA1和Pm RCA2两个蛋白,长度分别为480和440个氨基酸。序列分析发现两个蛋白质都具有RCA和AAA+蛋白家族(ATPase associated with various cellular activities)特异性结构域和定位于叶绿体的转运肽,Pm RCA1还具有RCA大同工型特有的由两个半胱氨酸(Cys)残基组成的保守结构。多重序列比对显示,这两个蛋白质序列分别与红花槭的RCA大同工型和小同工型的相似性达到78%。将Pm RCA1和Pm RCA2与20种不同物种RCA构建进化树,发现其与地中海松属于同一分支。研究结果为进一步分析马尾松RCA的功能和光合作用机制奠定了基础。     

花生病程诱导蛋白基因AhPIP1和启动子的克隆、序列分析及原核表达

本文采用RACE法克隆了花生病程诱导基因(pathogenesis-induced protein gene)全长,命名为AhPIP1,并在GenBank登录,登录号为EU860093.序列分析表明该基因的开放读码框579 bp,编码193个氨基酸.以YY20基因组DNA为模板PCR扩增获得AhPIP1基基因组序列长1 883 bp,包含3个外显子和长度分别为602 bp和600 bp的2个内含子.同源性比较发现AhPIP1与辣椒病程诱导蛋白CaPIP1(ABF72432,AAT35532)相似性达82%.采用Genome Walldng方法获得AhPIP1启动子,序列分析表明该启动子序列长513 bp,包含干旱胁迫、病程胁迫应答元件和生长素、赤霉素应答元件.构建pET32a-AhPIP1原核表达载体,转化表达受体菌Ecoli BL21,原核表达获得大小约40 kD AhPIPl融合蛋白,与推测的AhPIP1基因编码产物的大小一致,表明AhPIP1基因在大肠杆菌中能够表达.     

青稞脂质转运蛋白基因blt4.9的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了解脂质转运蛋白基因在青稞中的功能, 以青稞品种昆仑12为材料, 利用同源克隆得到青稞blt4.9基因序列(GenBank登录号为KU170187), 该基因的cDNA序列全长720 bp, 开放阅读框长348 bp, 编码115个氨基酸残基, 相对分子质量为11.2 kD, 理论等电点9.04, 不稳定系数为28.41, 是一个稳定的蛋白质。blt4.9编码的蛋白绝大多数属于疏水区, 没有较大的亲水区。序列比对显示, 该基因与大麦blt4.9基因编码蛋白的同源性最高(98.3%)。Real-time PCR分析结果显示, blt4.9基因在20%~30% PEG-6000、4℃以及50 mmol L^-1 ABA处理后表达量显著增加, 且在抗逆性强的青稞品种(旱地紫)中的表达量高于在抗逆性弱的品种(大麻)中, 推测该基因与青稞的抗逆性有关。该研究结果为利用青稞脂质转运蛋白基因改良青稞抗逆性奠定了基础。     

菜用大豆蔗糖转运蛋白基因Glyma18g15950的克隆及生物信息学分析

为了从分子水平上揭示菜用大豆蔗糖转运蛋白的结构特点,研究从菜用大豆‘闽豆6号’中同源克隆了蔗糖转运蛋白基因Glyma18g15950。经测序发现:该基因CDS长度为1794 bp,编码一个含有597个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,Glyma18g15950蛋白的等电点(pI)为5.81,分子量(Mw)为64.30 kD;为疏水性蛋白。SOMPA分析表明,各个氨基酸残基对应的二级结构分别为α螺旋42.47%、β折叠13.71%、无规则卷曲39.63%和β转角4.18%;氨基酸序列和结构分析显示Glyma18g15950蛋白包含MFS_2结构域。SignalP分析表明该蛋白没有信号肽。系统进化树分析表明菜用大豆Glyma18g15950蛋白与野生大豆(Glycine soja)的亲缘关系最近,同源性达97.34%。将该蛋白与拟南芥的9个SUC蛋白比对表明Glyma18g15950与AtSUC3的亲缘关系最近,属于SUT2亚族。     

陆地棉Pht1家族成员的全基因组鉴定及表达分析

【目的】磷是植物三大必需矿质元素之一,对植物的生长发育至关重要。Pht1家族的磷酸盐转运蛋白在植物磷吸收和转运方面具有重要作用,然而关于该基因的系统研究工作尚很少开展。本研究旨在进行Pht1家族成员全基因组鉴定和表达模式分析。【方法】通过生物信息学的方法对陆地棉Pht1家族成员的基因结构、编码蛋白质的结构、染色体定位、基因复制和表达情况等进行全面分析。【结果】(1)在陆地棉的基因组中共鉴定到17个磷酸盐转运蛋白基因(GhPT),其中A亚组包含8个GhPT,D亚组包含9个GhPT;(2)棉花GhPT蛋白之间序列相似性很高,并均具有12个疏水的跨膜区域;(3)进化分析表明这些GhPT蛋白主要聚为2大组(GroupⅠ和GroupⅡ),位于同一组的GhPT的编码基因大部分具有相似的内含子/外显子分布模式;(4)17个GhPT基因不均匀分布在A亚组和D亚组中的5条染色体上,串联复制和片段复制可能导致GhPT基因在陆地棉中的扩增;(5)表达模式分析表明,GhPT6和GhPT14在根中表达量最高,且同时响应低磷和低钾胁迫诱导并上调表达。【结论】这些结果将有助于深入了解Pht1家族基因的功能及离子信号途径相互作用的分子机制。     

喜树中ABA转运蛋白基因CaABAT的克隆及生物信息学分析

以喜树叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增喜树中的ABA转运蛋白基因CaABAT全长序列,并克隆到pGMT载体中,序列分析表明,CaABAT基因4 377 bp,编码1 458个氨基酸,等电点为7.82,分子量约为164.8 KD,且该基因与拟南芥中ABA转运蛋白基因At ABCG40氨基酸序列同源性高达73%,并将该序列提交至GenBank(No.KY882555)。该蛋白的二级结构中α-螺旋为49.45%,β-折叠为11.04%,无规则卷曲39.51%,定位细胞的质膜上。且该蛋白基因功能分类体系(Gene ontology)分析显示其具有ATPase依赖的跨膜转运活性,可能参与细胞内如含氮化合物代谢过程。然后分别分段导入至酵母表达载体pDRGAL与植物表达载体pBIGD中,构建重组质粒pDRGAL-CaABAT和pBIGD-CaABAT。最终为探究CaABAT转运ABA功能以及研究其对植物次生代谢调控奠定基础。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

割手密过氧化氢酶基因（Ss CA T-1）的克隆与比较分析

割手密是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有较强的抗逆性。本研究以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1) cDNA序列为探针,对甘蔗EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了2个割手密过氧化氢酶基因cDNA序列(Ss CA T-1c和Ss CA T-1d, GeneBank登录号为KF864229和KF864230)。2条序列全长均为1532 bp,包含10 bp的5'非翻译区(UTR)和43 bp的3'UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。2条序列之间相似性为99.2%,存在12个单核苷酸多态性(SNP)位点,蛋白相似性99.0%,存在5个氨基酸变异位点。将推测的SsCAT-1c和SsCAT-1d蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出极高的保守性。研究结果能对今后深入了解甘蔗及其近缘材料CAT基因家族的信息提供帮助,从而为进一步通过生物技术改良甘蔗品种抗逆性提供理论依据。     

甘蔗类甜蛋白基因ScTLP2和ScTLP3的生物信息学分析及表达

类甜蛋白(thaumatin-like proteins,TLPs)是一类与作物抵抗真菌病害紧密相关的病程相关蛋白。本研究从课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库中筛选获得两个甘蔗类甜蛋白基因(ScTLP2和ScTLP3),利用生物学软件对ScTLP2和ScTLP3基因进行序列特征、结构功能及聚类分析,采用qRT-PCR技术,检测ScTLP2和ScTLP3基因在不同甘蔗组织和黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)胁迫下的表达情况。生物信息学分析显示,ScTLP2基因全长1835 bp,包含1个969 bp的完整开放读码框,编码322个氨基酸;ScTLP3基因全长1259 bp,包含1个765 bp的完整开放读码框,编码254个氨基酸。ScTLP2和ScTLP3编码蛋白均含有THN家族的保守结构域和糖苷水解酶家族的64结构域(GH64-TLP-SF),两者分别隶属于TLPs家族中的Ⅵ类和Ⅰ类。q RT-PCR结果表明,ScTLP2和ScTLP3基因在甘蔗中均为组成型表达,其中ScTLP2基因在蔗叶中的表达量最高,是蔗皮的11.2倍,而ScTLP3基因在蔗芽中的表达量最高,是蔗皮的45.3倍。受黑穗病菌侵染后,ScTLP2基因在甘蔗抗黑穗病品种‘崖城05-179’中上调表达,而在感黑穗病品种‘ROC22’中无明显变化;相反的,Sc TLP3基因表达量在‘崖城05-179’中无明显变化,在‘ROC22’中上调表达。以上结果为深入研究甘蔗ScTLP家族基因的结构和功能积累了基础资料。     

割手密2个DREB2基因的克隆与比较分析

干旱应答元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein,DREB),在植物应对干旱、盐碱和低温胁迫的反应中起非常重要的调控作用。利用已知的甘蔗栽培种DREB2转录因子序列,设计引物,按照同源克隆的方法,获得了2个割手密DREB2基因组DNA序列,分别命名为Ss DREB2-a和Ss DREB2-f(Gen Bank登录号分别为:KU963272和KU963277)。序列分析结果表明,Ss DREB2-a基因序列全长为1 578 bp,Ss DREB2-f基因序列全长为1 729 bp,2个基因均包含1个内含子和2个外显子。Ss DREB2-a和Ss DREB2-f基因的c DNA序列全长分别为824 bp和971 bp,均编码262个氨基酸。序列比对分析显示,2个基因的序列相似性为96.6%,编码的蛋白相似性为98.9%,存在3个氨基酸变异位点。系统进化分析结果显示,割手密DREB2转录因子与高粱、牛鞭草、斑茅、玉米等植物的DREB2转录因子的同源关系最近。基因的获得为下一步了解DREB2基因表达与割手密抵御非生物胁迫能力之间的关系奠定了基础。     

樱桃病毒A外壳蛋白基因克隆及其原核表达

为制备樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)抗血清,克隆CVA外壳蛋白基因(CP),构建原核表达载体,优化蛋白表达条件。根据CVA全基因组序列(NC_003689.1)设计特异引物,RT-PCR方法扩增CVA外壳蛋白基因,克隆、测序,构建原核表达载体pET30a-CVACP,转化大肠杆菌BL21(DE3)株系,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。序列分析显示,该区段长为603 bp,编码201个氨基酸,与法国分离物PF(HQ267856.1)的同源性为96.8%,与印度分离物JKSPMi-5(FN669548.1)同源性为86.3%。成功构建了原核表达载体pET30a-CVACP,SDS-PAGE电泳分析显示,转pET30a-CVACP载体的BL21(DE3)菌株表达分子量约24 kDa的重组蛋白,该重组蛋白在37℃、1.5 mmol/L IPTG、诱导4 h条件下表达量最大。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

甘薯IbNPR1全长cDNA序列的分离与表达特性分析

在植物系统获得性抗性(SAR)中,NPR1蛋白是水杨酸介导的基因表达中关键调控因子。本研究以青农2号为试验材料,利用同源序列法和RACE技术分离甘薯SAR 途径的主要抗病信号元件NPR1 (none expresser of PR gene)的全长cDNA序列。序列分析表明,IbNPR1基因全长2 353 bp,包含一个编码586个氨基酸残基的开放阅读框,包含有类似拟南芥NPR1蛋白中的BTB/POZ和锚蛋白重复氨基酸序列结构域。聚类分析显示IbNPR1与来源于番茄的NPR1基因关系最近。Southern杂交及半定量RT-PCR分析表明,甘薯NPR1基因属于低拷贝基因家族,表达模式为组成型表达,并且SA能提高其表达水平。由该结果推测,IbNPR1可能在甘薯抵御病原物的侵染中起重要的作用。     

三色堇酪氨酸脱羧酶基因的克隆及其生物信息学分析

本研究以三色堇(Viola×wittrockiana Gam)为研究材料,采用RT-PCR和RACE等方法克隆可能与其花色形成相关的酪氨酸脱羧酶基因(Tyrosine decarboxylase),并对基因全长进行氨基酸序列的生物信息学分析。结果从三色堇中分离克隆出c DNA全长为1 634 bp的TYDC1和1 575 bp的TYDC2两个同源基因,包含相同的且长度为1 485 bp,编码494个氨基酸的开放阅读框;氨基酸多重序列比对和聚类分析结果表明:三色堇中的TYDC基因编码氨基酸和其他植物相关基因的一致性可达到82.43%,且与麻疯树的亲缘关系较近,达到73%;对TYDC蛋白的结构进行预测发现,TYDC蛋白是一种亲水性的不稳定蛋白,也是一种存在跨膜区域且不存在信号肽的非分泌蛋白;通过亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要在细胞核和细胞质中表达。本研究为揭示三色堇TYDC蛋白的结构功能务实了基础,为进一步研究和验证该基因在三色堇中的表达提供理论依据。