蓖麻RcFAH12基因cDNA全长克隆及生物信息学分析

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。本研究以蓖麻籽的RNA为模板,以Gen Bank上FAH12基因序列设计特异引物,运用RT-PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段。该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为蓖麻FAH12的cDNA全长序列。生物信息学分析,此片段包含1 164 bp组成的开放读码框(ORF),编码387个氨基酸,分子量为44 426.21 Da,p I=8.95。同源性分析结果表明,它与麻疯树、陆地棉、百脉根和杏的FAH12基因的同源性均高于70%。构建了系统进化树,蓖麻和麻风树、橡胶、木薯聚类到一起,这与生物学分类相同,都为大戟科植物。成功克隆蓖麻FAH12基因c DNA全长,这为后续进一步的分子生物学研究提供了帮助。     

金花茶CnLCYE基因cDNA克隆及表达载体构建

利用RT-PCR和RACE技术,从珍稀观赏植物金花茶(Camellia nitidissima)花瓣中克隆得到了一个番茄红素ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LCYE)基因c DNA全长,命名为CnLCYE。碱基序列分析显示,CnLCYE基因全长2 149 bp,包含291 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR)、265 bp的3'UTR和1 593 bp编码530个氨基酸的开放阅读框。该基因编码的蛋白质含有2个跨膜结构域,一个NADB_Rossmann superfamily结构域以及番茄红素ε-环化酶结构域(PLN02697)。CnLCYE蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠所占比例最少。氨基酸序列比对分析结果显示,CnLCYE与茄科、蔷薇科等植物LCYE蛋白同源性都在70%以上,与普洱茶(Camellia sinensis var.assamica)LCYE同源性最高。根据该CnLCYE全长序列设计带有KpnⅠ和Bam HⅠ位点的全长扩增引物扩增基因全长,用KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切后与表达载体p CAMBIA1300连接,成功构建了CnLCYE基因的正义表达载体,为深入研究CnLCYE基因的功能及其对花色的调控作用提供了帮助。     

油茶CoUXS1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

为了揭示油茶UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因的序列特点和结构功能,为该基因的深入研究和开发应用奠定基础。根据油茶种子EST文库中调取的UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因序列,设计特异引物,利用RT-PCR技术获得该基因全长cDNA克隆,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：该基因阅读框为1032 bp,编码344个氨基酸,具有典型的UXS家族模体序列。与海岛棉GhUXS3基因亲缘关系最近,定位于细胞质,有较强的亲水性,将该基因命名为CoUXS1,GenBank登录号为JN017094。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长的克隆和生物信息学分析

为了从分子水平深入了解鸭梨多酚氧化酶结构特点,基于已知的鸭梨多酚氧化酶基因cDNA片段序列设计引物,以鸭梨果实总mRNA为模板,对该基因cDNA 5’端和3’端未知序列进行了RACE扩增,最终获得鸭梨多酚氧化酶基因cDNA全长序列。该序列长度为2126 bp,开放性读码框位于136~1917 bp之间,可编码593个氨基酸残基。对该基因所翻译的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明基因编码的多酚氧化酶属酪氨酸酶超级家族成员,三级空间结构为可溶性球状蛋白,不具备跨膜结构,在细胞中的定位应该位于类囊体腔中。这些生物信息的获得将为今后应用生物技术开展鸭梨多酚氧化酶的调控从而抑制鸭梨果实褐变提供十分重要的参考资料。     

南方根结线虫延长因子2基因cDNA全长克隆和序列分析

以南方根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE,获得延长因子基因2 cDNA全长。此cDNA全长序列为2434 bp,包括2334 bp的完整ORF,编码一含777个氨基酸的多肽。该基因命名为Mi-eft2,其推导蛋白MI-EFT2的编码氨基酸与秀丽隐杆线虫的Ce-eft1,Ce-eft2,Ce-eft3,Ce-eft4基因的推导蛋白的同源性分别为26.7%、86.9%、13.8%和8.9%。蛋白功能分类预测MI-EFT2是一种在蛋白质延长过程中起作用的GTP水解酶,与真核生物的延长因子2功能相同。     

大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

为了克隆分析大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。采用RT-PCR和RACE法,从大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)肌肉中分离和克隆大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因。结果表明：大鳞副泥鳅β-肌动蛋白基因全长1710 bp,其中5 '-UTR长73 bp,3 '-UTR长509 bp,编码区长1128 bp,编码375个氨基酸。大鳞副泥鳅β-肌动蛋白与其他鱼类氨基酸的同源性大于98%,核苷酸同源性大于87%;系统进化分析表明：大鳞副泥鳅β-肌动蛋白在进化上高度保守;qRT-PCR结果表明：β-肌动蛋白基因在大鳞副泥鳅的肌肉、心、肝、脾、肠、胃、精巢和卵巢共8种组织中都有表达。研究结果不仅为利用β-肌动蛋白基因作为内参基因分析大鳞副泥鳅的基因表达研究提供了序列依据,而且可为大鳞副泥鳅的分子系统学研究提供序列参考。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。     

太子参肌动蛋白基因PhACT2的全长cDNA克隆与生物信息学分析

根据太子参肌动蛋白基因PhACT2的已知片段设计特异引物,采用RACE技术扩增全长cDNA,并通过生物信息学软件对该基因进行结构分析。通过测序及序列拼接获得PhACT2全长cDNA序列,开放阅读框为1 134 bp,编码377个氨基酸残基,分子量为41.79 k D,理论等电点为5.30。与其他植物同源序列进行分析表明,其核苷酸序列与甜菜的同源性较高为88%,氨基酸序列的同源性均在95%以上。进化分析表明,PhACT2与拟南芥At ACT7的氨基酸序列仅存在4个特异位点的氨基酸差异。实时荧光定量PCR分析结果显示,PhACT2在太子参的不同器官、组织中具有稳定的表达,可作为内参基因。PhACT2全长cDNA序列的成功克隆和生物信息学分析为其在分子生物学领域的应用奠定基础。     

猪TAK1基因的cDNA全长克隆、时空表达及亚细胞定位分析

为了研究转化生长因子β激活激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)在猪骨骼肌生长发育中的作用,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得猪TAK1的cDNA全长,并分析其时空表达及真核细胞中的亚细胞定位情况。结果表明,TAK1 cDNA全长2 163 bp(Gen Bank登录号:KU504629),ORF为1 740 bp,编码579个氨基酸,其氨基酸序列与人、恒河猴、绵羊的相似性均为98. 8%,表明该蛋白在不同物种间高度保守。猪TAK1蛋白具有催化丝氨酸/酪氨酸磷酸化的STKc_TAK1结构域,而在该结构域中还有多个保守的ATP结合位点、A-Loop结构域、TAB1(TGF-beta activated kinase 1)结合位点。荧光定量PCR结果显示,TAK1基因在出生后120 d大白猪的免疫器官脾脏中表达量最高,胰腺、背最长肌等组织中的表达量较低;而不同发育时期的背最长肌中,该基因在胚胎期65 d表达量最高,随着生长发育表达量下调;在不同品种间,TAK1基因在各时期大白猪中的表达量均高于梅山猪,除出生后90 d外,其他时期差异均达到显著水平或极显著水平。pcDNA3. 1(+)-EGFP-TAK1重组质粒转染C2C12细胞后的荧光共定位结果显示,TAK1蛋白的表达主要集中在细胞质中。综上,TAK1基因在猪骨骼肌发育过程中起着重要作用,为进一步研究猪TAK1基因的功能奠定了基础。     

烟草NtGAI基因的克隆及生物信息学分析

赤霉素是重要的植物内源激素,参与植物生长发育中的多个环节。赤霉素可影响烟草中烟碱生物合成,DELLA蛋白为赤霉素信号路径中的一个重要的负调控因子。本研究从烟草(Nicotiana tabacum)基因组中鉴定并克隆到一个烟草DELLA基因NtGAI,该基因CDS长为1 767 bp,编码587个氨基酸。生物信息学分析表明,NtGAI基因没有内含子,其编码的蛋白具有典型的DELLA蛋白结构域,是一个没有跨膜结构的疏水蛋白。聚类分析显示烟草NtGAI与林烟草(Nicotiana sylvestris)及辣椒具有较近的亲缘关系。本研究将为研究烟草中赤霉素调控路径提供有价值的参考数据。     

杨树SAMT基因的克隆及生物信息学分析

为了揭示水杨酸甲酯转移酶SAMT (Salicylic acid carboxyl methyltransferase)基因在杨树抗溃疡病中的功能。本研究采用RT-PCR技术和pGM-T克隆的方法,获得了‘84K杨’的SAMT基因序列,并对该基因编码的蛋白的理化性质、疏水性、结构域、功能、二级结构及亚细胞定位等进行了生物信息学分析。结果显示:该基因位于细胞质中,属于甲基转移酶7家族,为亲水性蛋白。预测结果为下一步研究该基因在杨树抗溃疡病中的功能提供了帮助,也为其在其他多年生木本植物中的功能研究提供了参考。     

草莓FaUVR8基因的cDNA克隆、生物信息学分析及原核表达条件优化

紫外线B(UV-B)对于植物生长发育具有重要调节作用,其中UV RESISTANCE LOCUS 8蛋白作为UV-B的光受体在植物响应UV-B过程中起关键作用。草莓是一种重要的经济果树,目前关于草莓的UV-B光受体报道较少。为研究草莓中UV-B受体蛋白,本研究采用同源克隆的方法获得‘丰香’草莓中编码UV-B光受体蛋白的c DNA序列,进行了生物信息学的分析并构建了原核生物表达载体p ET32a-UVR8,利用中心点响应面法优化了重组蛋白的诱导条件(包括诱导温度,IPTG浓度,菌液浓度和诱导时间)。结果表明:克隆得到了编码草莓UVR8蛋白的全长c DNA序列,命名为Fa UVR8,生物信息学分析表明该序列长1 317 bp,编码438个氨基酸,预测分子量为47.28 k D,等电点p I为5.85,重建蛋白质三维结构表明该蛋白包含7个β-片状螺旋结构;原核表达得到69.7 k D的融合蛋白,对四个诱导条件优化表明将工程菌培养至菌液OD600=0.7,加入浓度为0.55 mmol/L的IPTG,在27.72℃下诱导9 h,可获得最大量重组蛋白79μg/m L。研究结果可为后期寻找与Fa UVR8蛋白互作的下游蛋白,以及进一步开展其功能研究提供参考。     

香樟FPPS基因的克隆及生物信息学分析

本研究目的是克隆香樟法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase, FPPS)的cDNA序列,并开展生物信息学分析,为香樟植物萜类物质的合成及调控机理研究提供基础。本研究利用香樟转录组的测序数据,设计特异性PCR引物,应用反转录PCR技术扩增获得香樟FPPS基因,经生物信息学分析,对该基因编码的蛋白进行表征。香樟FPPS基因的开放读码框(ORF)序列全长为1 053 bp,编码350个氨基酸,蛋白分子量为40.42 kD,理论等电点为5.25。香樟FPPS是一个定位于细胞质,不含信号肽的不稳定亲水性蛋白,具有类异戊二烯类化合物合酶的特征结构域并含有7个保守结构域,氨基酸序列二级结构主要为α-螺旋。通过氨基酸序列的同源性分析发现,香樟CcFPPS的氨基酸序列与山苍子、陆地棉和野大豆等植物的FPPS氨基酸序列有较高的同源性。分子进化树分析表明,香樟CcFPPS蛋白与樟科植物山苍子FPPS蛋白的亲缘关系最近。本研究首次成功从香樟中克隆了CcFPPS基因并进行了生物信息学分析,为进一步研究CcFPPS基因在萜类合成调控的功能提供理论依据。     

月季EPSPS基因的克隆及生物信息学分析

月季是园林绿化中常用的花卉,因此十分有必要对其抗性基因进行研究。5-烯醇丙酮酸莽草酸3-磷酸合酶(EPSP; 3-磷酸莽草酸1-羧基乙烯基转移酶; EC 2.5.1.19)为莽草酸途径中的关键酶,也是除草剂草甘膦的靶向酶。为了探究月季EPSPS基因的结构和功能,本研究利用月季基因组信息设计特异引物克隆得到月季的EPSPS基因,命名为RcEPSPS。经RT-PCR克隆后得到RcEPSPS基因的ORF全长为1 566 bp,共编码521个氨基酸,分子质量为55.19 kD,等电点为7.5,亲水系数为0.009。初步研究得知RcEPSPS属于EPSPS I型蛋白,与同属蔷薇科的野草莓的序列同源性极高。研究结果可为后续抗性基因的利用提供理论基础。     

长穗偃麦草EeDREB2基因的克隆与生物信息学分析

为了进一步研究EeDREB2基因的结构和功能特点并为转基因小麦挖掘有效的候选基因,应用同源克隆的方法从长穗偃麦草中克隆出EeDREB2基因,通过生物信息学的手段对EeDREB2基因进行初步的分子特征分析。结果显示,该基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,理论上的等电点为4.85,分子量为37485.49 Da,属于亲水性蛋白,有20个磷酸化位点。亚细胞定位预测显示EeDREB2基因定位在细胞核中,表达谱分析预测表明EeDREB2在根、茎、叶、花、种子中都表达,其中叶中表达量最高。同源性分析发现,EeDREB2与TaDREB4B同源性最高。EeDREB2基因的克隆为转基因小麦的抗逆性研究提供了有效资源。     

花生AhLRPK1基因的克隆及生物信息学分析

植物受体蛋白激酶参与植物的生长发育,抗逆抗病防御反应、细胞分化、在宿主与病原菌互作过程中起着重要的作用。目前在花生上蛋白激酶基因研究较少。本研究基于前期多态性SNP标记的开发和QTL定位,获得了一个抗青枯病候选蛋白激酶基因;通过RT-PCR克隆技术获得了一段长为2 154 bp的ORF序列,暂命名为AhLRPK1;采用生物信息学方法预测并分析AhLRPK1基因编码的蛋白质常规理化性质,跨膜结构域、进化分析和高级结构等。结果表明AhLRPK1基因编码717个氨基酸为稳定的亲水性蛋白,含有一个信号肽、跨膜结构域、多个LRR基序以及一个激酶结构域;与拟南芥LRR亚家族进化同源性分析显示AhLRPK1属于LRRⅤ亚家族,与拟南芥的AT3G13065蛋白亲缘关系最近;AhLRPK1基因在花生基因芯片中表达模式分析表明,在茎和花中的表达量最大,在青枯菌诱导情况下,AhLRPK1基因在抗感花生品种中都表现出下调表达的趋势,AhLRPK1基因受乙烯利表达下调。这些结果有助于进一步验证其生物功能。     

MADS-box基因GmAP3的克隆及生物信息学分析

植物MADS盒基因蛋白是一类在生物发育过程中起着重要作用的转录因子家族。本研究在前期大豆花芽转录组测序分析的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个MADS-box基因的全长cDNA序列,利用生物信息学方法对它所编码的氨基酸基本性质和结构进行了系统分析。结果表明,该基因属于MIKC家族,为亲水性蛋白,稳定性较好;二级结构中同时含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲结构,其中α-螺旋和无规则卷曲所占比例均较高;亚细胞定位分析显示其定位在细胞核上;聚类分析表明该基因属于AP3亚家族,该基因编码的氨基酸与拟南芥AP3蛋白的同源性为41.18%,与大豆中GmNMH7的同源性最高为97%,命名该基因为GmAP3。本研究成功克隆出GmAP3基因,为该基因的进一步研究提供实验材料,并通过生物信息学分析预测,为下一步该基因的功能研究提供依据。     

丹参SmTIR1基因的克隆及生物信息学分析

生长素受体在植物生长素调控植物生长发育过程中起关键作用,而丹参的生长发育直接影响其品质,但目前有关丹参生长素受体基因的研究仍未见报道.本研究通过克隆获得一条全长1887 bp cDNA序列,并对所获得的克隆序列进行生物信息学分析.丹参生长素受体基因TIR1(命名为SmTIR1)具有典型的TIR1基因结构,通过预测其潜在...     

稗草EcHPPD基因的克隆及生物信息学分析

旨在克隆稗草对羟基苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)基因为探究其基因功能提供基础,从而更好地开发除稗剂。以稗草叶片为材料,用同源克隆和c DNA末端快速克隆(RACE)技术克隆Ec HPPD基因序列,用生物信息学软件分析其特征。Ec HPPD基因的编码序列全长1317 bp,其编码蛋白质由439个氨基酸组成,相对分子质量为46.659 k D,等电点为5.30。稗草与同处禾本科的Dichanthelium oligosanthes(OEL23409.1:8-249)的HPPD蛋白进化程度最为相近。Ec HPPD三级建模蛋白结构由两条链构成,有2个Fe²⁺结合位点,并能与吡唑特活性中心骨架通过氢键相互作用。Ec HPPD可能与HGO、HPT1、TAT3、AT5G36160、TAT7等11个蛋白产生互作。本研究报道了Ec HPPD基因序列并对其进行了生物信息学分析,为创制新的HPPD抑制剂提供理论依据。