马铃薯块茎休眠解除过程中NOX酶活性变化及其蛋白质结构分析

本研究测定了马铃薯块茎休眠解除过程中NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)的酶活性,用q RT-PCR方法检测了马铃薯St NOXs基因在块茎休眠解除过程中的相对表达量,并利用生物信息学方法分析了St NOX3基因编码蛋白质的可能结构和功能。情况表明:马铃薯块茎休眠解除过程中NOX酶活性呈升-降-升-降的动态变化过程;q RT-PCR情况显示St NOX3基因的相对表达量与NOX酶活性呈相同的变化趋势;生物信息学分析表明该基因编码940个氨基酸,蛋白质相对分子量为106 004.79,等电点为8.76。研究情况为进一步阐明St NOX基因家族在马铃薯块茎休眠解除过程中的作用奠定了基础。     

不同破眠处理对油桃休眠芽H2O2含量及 相关酶活性的影响

为进一步探讨H2O2代谢与果树芽自然休眠解除的关系,检测了人工破眠过程中‘曙光’油桃芽内H2O2含量和过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性的影响。选用的人工破眠处理分别为50℃高温（HT）处理、单氰胺（HC）处理和TDZ（TDZ）处理。结果表明,50℃高温和单氰胺效果相似,都能显著打破芽深休眠,并且抑制芽内CAT活性,引起H2O2含量增加,但2个处理对POD活性的影响都不大。TDZ打破深休眠的效果较差,对芽内H2O2含量、CAT活性、POD活性均未表现出显著影响。CAT活性抑制和H2O2积累可能是50℃高温和单氰胺打破自然休眠作用机制的重要组成部分。     

转PPase基因对马铃薯块茎休眠相关生理特性的影响

马铃薯块茎的休眠和发芽对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和加工等具有十分重要的意义。本研究以25℃室温条件下贮藏90d后的转正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯Favorita的块茎为材料,对贮藏块茎的PPase活性和及Pi、可溶性糖、淀粉、蛋白质含量进行了测定,以探讨PPase基因对马铃薯相关休眠生理特性的影响。结果表明,与对照相比,转正义PPase基因的两个株系F-2-1和F-2-4块茎中的PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量增加、淀粉含量和蛋白质含量降低,且与对照相比均达到极显著水平(只有F-2-4淀粉含量与对照相比无显著性变化);转反义PPase基因的两个株系F-1-1和F-1-2块茎中PPase活性、Pi含量和可溶性糖含量降低、淀粉含量增加,与对照相比均达到极显著性水平,而蛋白质含量与对照相比无显著性变化。     

马铃薯StNCED1基因过表达载体的构建及其遗传转化

马铃薯块茎的休眠和发芽对于块茎生产和加工极为重要,延长块茎休眠期有助于降低块茎水分和养分的消耗,从而提高其应用价值。本研究用PCR方法从马铃薯中克隆了9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(NCED)编码基因St NCED1,并构建了马铃薯块茎特异表达启动子CIPP驱动的St NCED1基因的植物过表达载体p BIC-St NCED1,然后通过根癌农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种"陇薯3号"获得转化植株,经卡那霉素抗性筛选得到5株抗性苗,PCR检测证明St NCED1基因已整合到马铃薯的基因组中。qRT-PCR检测表明St NCED1基因在转基因植株试管薯中的表达量分别比未转基因的对照增加2.10~8.09倍。该研究有助于培育块茎休眠期延长的马铃薯新种质。     

BR相关基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应分析

油菜素内酯(BR)是调控植物生长发育的重要激素。本项目组研究发现,BR合成和信号转导基因表达量均随马铃薯块茎休眠解除而升高,抑芽剂可明显抑制BR合成相关基因delta24-甾醇还原酶(DWF1)、甲基甾醇单加氧酶(SMO1)、信号转导成员油菜素内酯不敏感蛋白(BRI1)、信号转导激酶(BSK)和信号激活因子细胞周期蛋白(CYCD3)等在马铃薯块茎中的表达。还发现,低温可以显著延长马铃薯‘费乌瑞它’等品种的贮藏时间,而对‘米拉’等品种的作用不显著。为进一步探明BR合成、信号转导和激活基因在低温调控马铃薯萌芽中的响应情况,本试验以休眠中后期的马铃薯‘费乌瑞它’和‘米拉’原原种为材料,采用常温(23±2)℃和低温(4℃)贮藏,利用q RT-PCR技术测定两个品种在萌芽过程中5个BR合成、信号转导及激活关键基因的表达量变化。结果表明,低温下,两个品种中的DWF1、BRI1基因在萌芽过程中的表达量保持在低水平;SMO1、BSK和CYCD3基因的表达量在‘费乌瑞它’的萌芽阶段维持在低水平,而在‘米拉’中的表达量却呈相对较高的水平。由此推测低温通过抑制SMO1、BSK和CYCD3基因在‘费乌瑞它’萌芽过程中的表达,抑制萌芽,而有效延长马铃薯贮藏时间。与低温显著延长该品种贮藏时间、延迟萌芽的效果一致。本研究为阐明马铃薯萌芽过程中BR调控机制及其与环境温度的关系,利用分子技术辅助选育耐贮藏品种,以及为马铃薯贮藏调控新技术研发提供新的依据。     

PVY引起马铃薯块茎细胞坏死的相关基因研究

本研究采集健康马铃薯块茎和被PVY侵染的马铃薯块茎为材料,选取马铃薯RCCR基因和LSD1基因为目标基因。首先提取总RNA后通过反转录PCR(RT-PCR)、琼脂糖凝胶电泳,证明RCCR基因和LSD1基因成功获得,然后进行荧光定量PCR(qPCR)测定在PVY侵染的马铃薯块茎中RCCR基因和LSD1基因的相对表达量,最后又进行了目标基因编码蛋白的结构分析。结果表明,这2个基因的相对表达量均有所下降,推测这2个基因与马铃薯块茎细胞坏死相关,为之后研究PVY引起马铃薯块茎细胞坏死的相关分子机制做了前期探索,为今后的分子育种和抗病药物筛选提供了可选的靶点。     

长山药块茎休眠期相关酶活性及内源激素含量变化

以2个长山药栽培品种为材料,从采收到出苗设计了5个时期,研究其块茎内部相关酶活性及内源激素含量的变化,结果表明:休眠期间块茎内淀粉酶和淀粉磷酸化酶活性较低,随着休眠的解除活性逐渐升高;过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)在块茎深度休眠时活性较高,休眠解除块茎萌动后活性迅速下降,不同品种间以上几种酶的变化趋势基本相...     

马铃薯块茎休眠及萌发过程中几种酶活性变化

以马铃薯脱毒试管薯为试验材料，研究块茎休眠和块茎顶芽萌发生长过程中几种相关酶活性变化。结果表明，块茎贮藏过程中淀粉酶、淀粉磷酸化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性的消长，与块茎形态上的休眠及萌发有密切关系。处于休眠期间的块茎内淀粉酶和淀粉磷酸化酶活性很低，随着休眠的解除及顶芽萌动活性逐渐增强，当顶芽开始生长时活性再镒降低；过氧化物酶和多酚氧化酶在块茎休眠时活性较高，顶芽萌动后活性迅速下降；不同品种间这四种酶的变化趋势基本相同。     

油菜素内酯合成和信号转导基因在马铃薯块茎贮藏期间的表达变化及对萌芽的影响

为探明油菜素内酯BR在块茎萌芽中的作用,建立更有效的种薯催芽调控体系,选择了休眠期不同的3个品种,利用q RT-PCR分析与BR合成、信号转导、调控有关的9个基因在贮藏期间及抑芽处理下的表达模式;同时检测BR类似物24-表油菜素内酯(24-e BL)及其与赤霉素GA3对块茎萌芽的影响。结果表明,涉及BR合成的4个基因表达量均随贮藏时间延长升高,短休眠品种升高的时间点早于中、长休眠品种;信号转导及调控基因中BRI1和CYCD3的变化与合成基因相似,BSK和TCH4的表达量则在中、长休眠期品种中保持恒定。抑芽处理在贮藏前期能刺激这些基因的表达升高,但之后都迅速下降并保持低水平。转录因子BZR1在各品种中以及抑芽处理下均没有明显变化。24-e BL利于块茎解除休眠,但不促进芽的伸长生长,与GA3互配效果更佳,单株块茎增重37.92%~98.41%。结论表明,BR合成和信号转导是块茎从休眠向萌芽转变的必经生理过程,它与GA3互配用于催芽更利于种薯萌芽的整齐、健壮并促进块茎形成。     

马铃薯晚疫病抗性相关基因StDIR1的克隆与表达

马铃薯是世界性粮蔬作物。致病疫霉引起的晚疫病则是马铃薯育种所面临的最严峻问题之一,因此,分离和利用马铃薯晚疫病抗性基因获得抗病新品种是马铃薯育种的重要目标。首先在连翘中发现的一类与木质素合成相关的Dirigent基因可能在植物抗病虫害过程中起重要作用。试验根据马铃薯的EST序列信息设计特异性引物,并通过RT-PCR和RACE技术获得了一条全长为729 bp的Dirigent基因cDNA序列,命名为StDIR1;该cDNA编码一个包含191个氨基酸的蛋白质多肽;系统进化分析表明,该多肽是一种Dirigent-like蛋白,属于DIR-b亚群,与陆地棉Di-rigent-like protein 1相似性高达76%,同一性为62%。利用半定量RT-PCR技术分析发现,致病疫霉、H2O2以及NO可以诱导该基因不同程度的上调表达。组织特异性分析表明,该基因在马铃薯根组织中表达量最高,而在茎、叶、花以及块茎组织中的表达量偏低。首次表明StDIR1基因与马铃薯对致病疫霉的侵染应答具有相关性。     

基于侯选基因标记的四倍体马铃薯休眠QTL关联分析

休眠期是马铃薯(SolanumtuberosumL.)重要的块茎性状之一,寻找调控马铃薯块茎休眠的关键基因,揭示其分子机制以选育具有适宜休眠期长度的马铃薯品种,对于解决当前马铃薯产业中过长或过短休眠期带来的经济损失和食品安全隐患等问题十分关键。前期研究在二倍体马铃薯连锁群体中定位了6个加性休眠QTL,本研究拟在四倍体马铃薯育种材料中验证这些休眠QTL。基于休眠QTL连锁的候选基因标记,采用混合线性模型(MLM),模型中考虑群体结构和亲缘关系(Q+K),在四倍体马铃薯自然群体St-hzau中对马铃薯块茎休眠期进行了关联分析。5号染色体上休眠QTL DorB5.3连锁的候选基因标记S199_300和GWD (根据葡聚糖水双激酶α-glucan water dikinase基因设计)与马铃薯块茎休眠期具有显著的关联(P0.05),分别解释了休眠期表型变异的7.8%和3.2%,分别能增加休眠期7.1 d和4.5 d,即在二倍体马铃薯连锁群体中定位的稳定主效休眠QTL DorB5.3在四倍体马铃薯关联群体St-hzau中也表现显著, DorB5.3的稳定性在关联分析结果中得到了验证,表明候选基因标记策略在马铃薯块茎休眠QTL关联分析中是一种有效的策略。本研究所验证的主效休眠QTL DorB5.3及相应连锁标记可以直接用于马铃薯休眠育种。据此可以推测GWD可能在控制还原糖含量和块茎休眠2个方面均发挥作用,马铃薯块茎休眠机制与还原糖含量变化机制可能存在着部分交叉。     

异源表达棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(Gh SAMDC1)基因提高了拟南芥抗盐能力

以转GhSAMDC1基因拟南芥研究了过量表达GhSAMDC1基因对拟南芥幼苗抗盐能力的影响,以及内源多胺、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、叶绿素含量(Chl)、离子渗透率、抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性和表达量在盐胁迫下的变化。结果表明,过量表达GhSAMDC1基因能够减少拟南芥内源腐胺(Put)含量,增加亚精胺(Spd)和精胺(Spm)含量。盐胁迫下,转基因株系亚精胺合酶(AtSPDS1、AtSPDS2)和精胺合酶(AtSPMS)基因表达量明显高于野生型,Spd和Spm含量进一步增加,H2O2、MDA、Chl以及离子渗透率显著降低;与野生型相比,过氧化物酶(POD)活力无明显差异,但超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力明显增加,其表达水平与活力变化趋势基本一致。因此,盐胁迫下,GhSAMDC1基因通过提高Spd和Spm合成相关基因的表达,增加了转基因株系Spd和Spm含量,Spd和Spm直接或间接提高抗氧化系统相关酶的活力,通过清除H2O2等活性氧的方式提高拟南芥的抗盐能力。     

抗锈小麦新品系与感病品种甘麦8号的水杨酸含量和相关酶类活性的变化

抗锈小麦新品系89144接种锈菌后SA含量升高,同时CAT活性降低,H2O2含量升高,SOD活性升高,在不抗锈品种甘麦8号接种锈菌后SA含量也有升高,但并不伴随有CAT活性下降和SOD活性升高以及H2O2含量的升高.推测SA为CAT过氧化活性提供一个电子的过程中SA的量必须达到一定的阈值,并且与CAT的时序调节相配合.据SA结合态和游离态含量的变化     

梨休眠DELLA蛋白PpGAI基因的克隆与表达分析

赤霉素(gibberellins,GA)通过DELLA蛋白的去阻遏作用来调控植物生命循环过程。为研究DELLA蛋白在梨花芽休眠过程表达情况及功能,以不同砂梨品种‘蜜雪梨’和‘黄花梨’为试材,分别采集整个休眠时期花芽,利用转录组测序数据、梨基因组CDS数据库筛选梨DELLA蛋白编码基因Pp GAI。分离并克隆得到两条Pp GAI基因,其开放阅读框(ORF)分别为1 743 bp和1 905 bp,命名为Pp GAI-1和Pp GAI-2,Gen Bank登录号为KU311002和KU311003,编码580和634个氨基酸,预测其均为亲水性蛋白,其蛋白分子量为62.98 k D和69.72 k D。进化树分析表明Pp GAI-1与苹果的亲缘关系最近,而Pp GAI-2与杜梨的亲缘关系最近。荧光定量研究显示在‘蜜雪梨’中两个Pp GAI基因均在休眠期出现一个表达低峰,在休眠解除临界期、休眠解除期和萌动期出现3个表达高峰;在‘黄花梨’中两个Pp GAI基因均在休眠解除临界期明显上调表达,并在萌动期达到最大表达峰值。本研究所获得梨两个编码DELLA蛋白Pp GAI基因对梨花芽休眠解除起到调控作用,且在不同砂梨品种间的休眠调控模式有所不同。     

大白菜中保护酶活性及H2O2含量变化与TuMV抗性关系的研究

选取抗TuMV的8407、河304和感TuMV的冠291和春月黄为试验材料,于苗期接种TuMV-C4,接种后测定24 d内叶片中超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）这3种过氧化氢代谢相关酶的活性以及过氧化氢H2 O2的含量。结果表明：接种TuMV后, POD、CAT的活性及H2 O2含量的变化在不同材料之间存在明显差异。抗病材料在接种后,POD、CAT的活性及H2 O2含量虽有变化,但均能逐渐恢复正常;感病材料在接种后,POD、CAT的活性及H2 O2含量均有较大变化,且始终无法恢复正常。总体而言,叶片中的H2 O2和CAT与大白菜的TuMV抗性关系较为紧密,其次是POD,而SOD与TuMV抗性的关系不大。     

马铃薯StKNOX1基因的克隆及表达分析

KNOX基因是一类转录调控因子,其和植物的生长发育密切相关。为了探讨同源异型盒(KNOX)基因在马铃薯(Solanum tuberosum L.)块茎发育中的作用,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了1个KNOX同源基因,且根据属性情况命名为StKNOX1,其属于KNOX家族I类蛋白,编码含344个氨基酸的蛋白,包含KNOX1、KNOX2、ELK等结构域。根据相关生物信息研究结果,该基因编码的蛋白与番茄中KNOX1的一致性最高(93.7%)。StKNOX1基因在马铃薯的各组织器官中均有表达,在根和块茎中的表达水平显著高于其他部位的表达水平。本研究将为进一步开展基因功能研究奠定理论基础,为马铃薯生物技术育种提供基因资源。     

溴乙烷破除马铃薯休眠的效果及激素变化研究

研究溴乙烷破除马铃薯休眠的效果及其在此过程中内源激素含量的变化,并在激素水平上初步探讨了溴乙烷破除马铃薯休眠的机理,以期为生产上应用溴乙烷破除马铃薯休眠提供参考。以‘薯引1号’、‘大西洋’和‘克新1号’3个马铃薯品种的试管薯为材料,利用溴乙烷打破块茎的休眠,测定休眠强度、休眠幅度和内源激素含量的变化。结果表明,适宜浓度的溴乙烷使3个品种的休眠期分别缩短了33天、45天、46天,效果显著。另外,在休眠过程中,块茎的内源IAA和ABA含量比较高,而GA和ZR的含量较低。GA和ZR的含量呈现单峰曲线变化,溴乙烷处理会使波峰出现提前;在处理起始阶段,GA的含量高于对照。溴乙烷可能通过调节GA和ZR的含量来破除试管薯的休眠。     

马铃薯StCYP85A3促进萌芽及根系伸长的功能解析

油菜素内酯(BR)是一类植物甾醇类激素,对植物生长发育及胁迫应答具有显著的调控作用,马铃薯中StCYP85A3作为BR合成酶的编码基因,功能仍待进一步探究。本研究从‘川芋10号’马铃薯中克隆出该基因,生物信息学分析表明该蛋白具有催化BR合成的典型亲氧结合域,属于CYP85As家族成员。通过组织表达分析发现该基因在块茎芽眼及根中表达量最高,且芽眼中的表达量随着储藏时间的延长而增加,在块茎芽眼休眠解除时表达迅速升高。同时发现外源BR可诱导马铃薯芽眼及根中StCYP85A3表达量升高,从而显著促进了种薯萌芽及幼苗根的伸长。通过在拟南芥野生型及cyp85a2突变体中过表达StCYP85A3发现,过表达株系种子萌发及根系伸长都早于野生型,同时回补株系弥补了突变体种子萌发、植株根系生长迟缓的缺陷。此外,外源BR对过表达株系种子萌发、根系伸长无显著促进作用,但显著促进了野生型、突变体及回补株系种子萌发、根系伸长。上述马铃薯及拟南芥试验结果表明, StCYP85A3具有促进萌芽及根系伸长的功能。     

冬小麦抗旱性与膜脂过氧化的关系及其氮素调控机理

在大田试验条件下,测定了两个不同抗旱性小麦品种郑麦9023（水地品种,抗旱性差）和长武134（旱地品种,抗旱性强）在不同施氮量条件下拔节期叶片MDA、H2O2含量以及SOD、CAT活性的变化。结果表明,抗旱性和小麦叶片的保护酶活性和膜质伤害物质的含量密切相关,而且受氮素营养的调控。抗旱品种相对不抗旱品种具有较高的SOD和CAT活性,而MDA和H2O2较低;MDA和H2O2含量随施氮量的增加呈现先降后升的趋势,而SOD和CAT则呈相反的变化趋势。     

马铃薯储藏期花青素变化及合成相关基因表达分析

目前植物花青素合成机理研究深入,但花青素降解机制及组分变化研究鲜少。储藏过程对彩色马铃薯品质影响较大,然而关于储藏期间马铃薯块茎中花青素含量及组分变化的规律及机制研究尚不完全清楚。本试验测定了不同储藏期间的2种彩色马铃薯的花青素含量、组分,还原糖含量。同时,利用qRT-RCR对花青素代谢相关基因(StPAL、StC4H、St4CL、StF3’H、StDFR、StUFGT、StF3’5’H、StAN1和StbHLH1)表达量进行分析。结果表明,随着储藏时间延长,花青素的总含量下降,主要组分减少,所有基因表达量均降低(黑金刚中StDFR例外),变化规律与花青素的降解规律基本一致;还原糖储藏期间缓慢升高可能影响花青素变化。本试验研究结果对彩色马铃薯储藏期间花青素含量的保持具有指导意义,可为彩色马铃薯品种的选育及资源的合理利用提供理论参考。